Strumenti di editing delle basi mediati da CRISPR: una tecnica di editing del genoma per indurre una sostituzione di basi mirata

Per l'editing del genoma mediato da CRISPR, iniziare con la coltura HAP1-BE3, una linea cellulare aploide con un gene BE integrato che codifica per un enzima editor di basi. A questa coltura, aggiungere vettori lentivirali contenenti plasmide CRISPR-Cas9 progettati per un bersaglio specifico come il gene del cancro al seno umano, BRCA1.

La particella del lentivirus si fonde con la membrana della cellula ospite, rilasciando il plasmide, che alla fine si integra nel genoma della cellula ospite per formare i segmenti genici CRISPR-Cas9-BE. Questi geni generano un gRNA mirato a BRCA1, l'endonucleasi Cas9 e la BE-citidina deaminasi.

Il gRNA che ha come bersaglio BRCA1 è un RNA che si fonde con Cas9 e dirige il complesso verso il locus del gene BRCA1. Vicino a questo gene, il locus è un Protospacer Adjacent Motif, o PAM, dove BE può attraccare stabilmente e spostarsi a monte per raggiungere la sua regione catalitica attiva. Qui, il BE riconosce una base di citidina e la converte in uridina.

Questa mutazione di sostituzione di basi innesca la nucleasi Cas9 per tagliare il filamento di DNA non modificato. La rottura del filamento di DNA attiva gli enzimi di riparazione che riempiono la base mancante e convertono l'uracile, una base non DNA, in timina. Nel complesso, questi processi generano una variante genetica.

Ora, incubare le cellule in condizioni fisiologiche e in subcoltura per moltiplicare la variante genetica. Estrai il DNA genomico e sequenzialo per analizzare l'efficienza dell'editing di base mediato da CRISPR.

Seminare 5 x 10⁵ cellule HAP1-BE3 per pozzetto in piastre da 24 pozzetti un giorno prima della trasfezione e coltivarle per raggiungere una confluenza dal 70% all'80% per la trasfezione. Trasfettare gli RNA guida mirati a BRCA1 utilizzando i reagenti di trasfezione acquistati, secondo il protocollo del produttore. Utilizzare 1 microgrammo di RNA guida di targeting BRCA1 per indurre la conversione da CG a TA nei siti target di BRCA1. Quindi, incubare le cellule a 37 gradi Celsius e sottocolture ogni 3 o 4 giorni. Raccogliere i pellet cellulari 3, 10 e 24 giorni dopo la trasfezione per analizzare l'efficienza dell'editing delle basi. Estrai il DNA genomico utilizzando il kit di purificazione del DNA genomico.