Trasformazione genica basata su vettori cromosomici artificiali batterici binari nelle piante di Arabidopsis: una tecnica per generare piante transgeniche con inserimento a copia singola

Inizia con le piante di Arabidopsis che portano capolini immaturi. Immergere i capolini in una sospensione cellulare di Agrobacterium che trasporta T-DNA clonato con cromosoma artificiale batterico binario o BIBAC, un vettore che si replica in entrambi i sistemi E. coli e Agrobacterium. Questo vettore binario T-DNA può fornire grandi transgeni come il gene di resistenza agli erbicidi e marcatori selezionabili fluorescenti lungo un promotore specifico del seme.

Mentre i capolini sono ancora immersi, agita delicatamente le piante per migliorare il loro contatto con l'Agrobacterium. Con la sua capacità intrinseca di infettare le piante, l'Agrobacterium trasferisce il transgene nella cellula floreale. Quando il transgene entra nella cellula, si sposta verso il nucleo e si fonde con il genoma della pianta.

Ora, avvolgi la pianta nella pellicola trasparente e incubala al buio per trattenere l'umidità e migliorare la trasformazione. Rimuovere la pellicola e far crescere le piante in condizioni fisiologiche fino a quando non producono semi.

Successivamente, raccogli i semi e osserva al microscopio a fluorescenza per selezionare i trasformanti. Ora, coltiva i semi trasformati in condizioni adeguate fino alla germinazione. Spruzzare le piante con erbicida e incubare.

Le piante con inserzione multipla di transgeni subiscono il silenziamento genico e appassiscono, mentre le piante con un'inserzione a copia singola esprimono un enzima attivo che metabolizza l'erbicida e sopravvivono al trattamento. Estrarre il DNA genomico dai trasformanti sopravvissuti ed eseguire la PCR per calcolare l'efficienza dell'inserimento di una singola copia.

Per preparare le piante di Arabidopsis alla trasformazione, coltiva le piante di Arabidopsis in una serra o in una camera di crescita a clima controllato, fino alla fioritura. Aggancia i primi bulloni per consentire l'emergere di più bulloni secondari. Le piante sono pronte per l'immersione da quattro a sei giorni dopo la tosatura, quando le piante hanno molti capolini immaturi e non molte silique fecondate.

Per eseguire l'immersione floreale, immergere le infiorescenze per 5-10 secondi in sospensione di Agrobacterium. Usa un'agitazione delicata. Avvolgi le parti fuori terra delle piante nella pellicola trasparente per mantenere alta l'umidità e copri i vasi delle piante con una scatola per mantenere le piante al buio.

Incubare le piante per due giorni in una serra o in una camera di crescita. Dopo due giorni, rimuovi la scatola e la pellicola trasparente e fai crescere le piante fino alla maturità in una serra o in una camera di crescita. Per aumentare l'efficienza della trasformazione, le stesse piante possono essere riimmerse sette giorni dopo la prima immersione.

Successivamente, quando le piante trasformate sono mature e secche, raccogli i semi. Raggruppa e analizza i semi delle piante trasformate con lo stesso costrutto in un unico set. Nel caso in cui le piante vengano trasformate con un derivato plasmidico BIBAC-RFP-Gateway, identificare le piante transgeniche analizzando i semi utilizzando la microscopia a fluorescenza.

Per rilevare l'espressione di DsRed nei rivestimenti dei semi, è necessario visualizzare i semi a un'eccitazione di 560 nanometri e un'emissione da 600 a 650 nanometri. Separare i semi fluorescenti dalle controparti non fluorescenti usando una pinza.

Per lo screening delle piante transgeniche trasformate con un derivato plasmidico BIBAC-BAR-Gateway, seminare i semi in vassoi pieni di terra. Garantire una distribuzione uniforme dei semi sui vassoi, sospendendo i semi in agar allo 0,1% in terreno 0,5X MS e distribuire i semi utilizzando una pipetta da 1 millilitro.

Stimola i semi a germogliare in modo sincrono incubando i semi per almeno due giorni a 4 gradi Celsius. Questo può essere fatto prima o dopo la semina. Due e tre settimane dopo la semina, spruzzare le piantine con una soluzione di glufosinato-ammonio allo 0,5%. Utilizzare 500 millilitri di soluzione di glufosinato-ammonio per 1 metro quadrato. Trasferisci le piantine sopravvissute in vaso. Analizzare le piante resistenti al glufosinato-ammonio, mediante PCR per la presenza del costrutto di interesse.