Name: Generazione di piante transgeniche con inserimenti di copia singola utilizzando il vettore binario BIBAC-GW (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: Impara a generare piante transgeniche con inserimenti di copia singola integri utilizzando il vettore binario BIBAC-GW. Questo metodo facilita la creazione efficiente di piante Arabidopsis stabili.

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Questa ricerca è sostenuta dall'olandese Technology Foundation STW (12385), che fa parte dell'organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NWO), e che è in parte finanziato dal Ministero degli affari economici (OTP Grant 12385 a MS).  Ringraziamo Carol M. Hamilton (Cornell University, Stati Uniti) per la fornitura di pCH20, la spina dorsale dei vettori BIBAC-GW.

<ol><li>Jorgensen, R. A., Cluster, P. D., English, J., Que, Q., Napoli, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chalcone+synthase+cosuppression+phenotypes+in+petunia+flowers%3A+comparison+of+sense+vs.+antisense+constructs+and+single-copy+vs.+complex+T-DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chalcone synthase cosuppression phenotypes in petunia flowers: comparison of sense vs. antisense constructs and single-copy vs. complex T-DNA sequences.</a> Plant Mol Biol. 31 (5), 957-973 (1996).</li>
<li>Stam, M., et al. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.1365-313X.1997.12010063.x">Post-transcriptional silencing of chalcone synthase in Petunia by inverted transgene repeats.</a> Plant J. 12, 63-82 (1997).</li>
<li>Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N., Kooter, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-dependent+methylation+and+transcriptional+silencing+of+transgenes+in+inverted+T-DNA+repeats%3A+implications+for+posttranscriptional+silencing+of+homologous+host+genes+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Position-dependent methylation and transcriptional silencing of transgenes in inverted T-DNA repeats: implications for posttranscriptional silencing of homologous host genes in plants.</a> Mol Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).</li>
<li>Jin, Y., Guo, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgene-induced+gene+silencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgene-induced gene silencing in plants.</a> Methods Mol Biol. 1287, 105-117 (2015).</li>
<li>Oltmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.plantphysiol.org/content/152/3/1158">Generation of Backbone-Free, Low Transgene Copy Plants by Launching T-DNA from the Agrobacterium Chromosome 1[W][OA].</a> Plant Physiol. , (2010).</li>
<li>Ye, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+production+of+single+copy+backbone-free+transgenic+plants+in+multiple+crop+species+using+binary+vectors+with+a+pRi+replication+origin+in+Agrobacterium+tumefaciens%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Enhanced production of single copy backbone-free transgenic plants in multiple crop species using binary vectors with a pRi replication origin in Agrobacterium tumefaciens.</a> Transgenic Res. , (2011).</li>
<li>Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+binary-BAC+system+for+plant+transformation+with+high-molecular-weight+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">A binary-BAC system for plant transformation with high-molecular-weight DNA.</a> Gene. 200 (1-2), 107-116 (1997).</li>
<li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation%3A+an+analysis+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: an analysis in tomato.</a> Transgenic Res. 10 (2), 121-132 (2001).</li>
<li>Vega, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transformation+of+maize+%28Zea+mays%29+with+Cre-lox+site+specific+recombination+cassettes+in+BIBAC+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transformation of maize (Zea mays) with Cre-lox site specific recombination cassettes in BIBAC vectors.</a> Plant Mol Biol. 66 (6), 587-598 (2008).</li>
<li>Anggoro, D. T., Tark-Dame, M., Walmsley, A., Oka, R., de Sain, M., Stam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BIBAC-GW-based+vectors+for+generating+reporter+lines+for+site-specific+genome+editing+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">BIBAC-GW-based vectors for generating reporter lines for site-specific genome editing in planta.</a> Plasmid. 89, 27-36 (2017).</li>
<li>Hamilton, C. M., Frary, A., Lewis, C., Tanksley, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+transfer+of+intact+high+molecular+weight+DNA+into+plant+chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Stable transfer of intact high molecular weight DNA into plant chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9975-9979 (1996).</li>
<li>Belele, C. L., Sidorenko, L., Stam, M., Bader, R., Arteaga-Vazquez, M. A., Chandler, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+tandem+repeats+are+sufficient+for+paramutation-induced+trans-generational+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Specific tandem repeats are sufficient for paramutation-induced trans-generational silencing.</a> PLoS Genet. 9 (10), e1003773(2013).</li>
<li>Shizuya, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+and+stable+maintenance+of+300-kilobase-pair+fragments+of+human+DNA+in+Escherichia+coli+using+an+F-factor-based+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cloning and stable maintenance of 300-kilobase-pair fragments of human DNA in Escherichia coli using an F-factor-based vector.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (18), 8794-8797 (1992).</li>
<li>Shi, X., Zeng, H., Xue, Y., Luo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pair+of+new+BAC+and+BIBAC+vectors+that+facilitate+BAC%2FBIBAC+library+construction+and+intact+large+genomic+DNA+insert+exchange%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">A pair of new BAC and BIBAC vectors that facilitate BAC/BIBAC library construction and intact large genomic DNA insert exchange.</a> Plant Methods. 7, 33(2011).</li>
<li>Woodman, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+PCR+of+Intact+Bacteria+%28Colony+PCR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Direct PCR of Intact Bacteria (Colony PCR).</a> Curr Protoc Microbiol. , A.3D.1-A.3D.7 (2016).</li>
<li>Ausubel, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mol+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Mol Biol.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 1, (2003).</li>
<li>Edwards, K., Johnstone, C., Thompson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+rapid+method+for+the+preparation+of+plant+genomic+DNA+for+PCR+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A simple and rapid method for the preparation of plant genomic DNA for PCR analysis.</a> Nucleic Acids Res. 19 (6), 1349(1991).</li>
<li>Clarke, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cetyltrimethyl+ammonium+bromide+%28CTAB%29+DNA+miniprep+for+plant+DNA+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cetyltrimethyl ammonium bromide (CTAB) DNA miniprep for plant DNA isolation.</a> Cold Spring Harb Protoc. (3), (2009).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923 (2012).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="https://www.cshlpress.com/default.tpl?cart=1522085010728111106&fromlink=T&linkaction=full&linksortby=oop_title&--eqSKUdatarq=934">Molecular Cloning</a>. , CSH Press. (2012).</li>
<li>Sosa, J. M. <a target="_blank" href="https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac50056a031?journalCode=ancham">Chromatography with Sephadex Gels.</a> Anal Chem. 52 (6), 910-912 (1980).</li>
<li>Depicker, A., Stachel, S., Dhaese, P., Zambryski, P., Goodman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nopaline+synthase%3A+transcript+mapping+and+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Appl+Genet%22%5BJournal%5D)">Nopaline synthase: transcript mapping and DNA sequence.</a> J Mol Appl Genet. 1 (6), 561-573 (1982).</li>
<li>Feng, J., Vick, B. A., Lee, M. K., Zhang, H. B., Jan, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+BAC+and+BIBAC+libraries+from+sunflower+and+identification+of+linkage+group-specific+clones+by+overgo+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Theor+Appl+Genet%22%5BJournal%5D)">Construction of BAC and BIBAC libraries from sunflower and identification of linkage group-specific clones by overgo hybridization.</a> Theor Appl Genet. 113 (1), 23-32 (2006).</li>
<li>Lee, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+plant-transformation-competent+BIBAC+library+and+genome+sequence+analysis+of+polyploid+Upland+cotton+%28Gossypium+hirsutum+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Construction of a plant-transformation-competent BIBAC library and genome sequence analysis of polyploid Upland cotton (Gossypium hirsutum L).</a> BMC Genomics. 14, 208(2013).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+insert+Thellungiella+halophila+BIBAC+library+for+genomics+and+identification+of+stress+tolerance+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">A large insert Thellungiella halophila BIBAC library for genomics and identification of stress tolerance genes.</a> Plant Mol Biol. 72 (1-2), 91-99 (2010).</li>
<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+BAC-+and+BIBAC-based+physical+map+of+the+soybean+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A BAC- and BIBAC-based physical map of the soybean genome.</a> Genome Res. 14 (2), 319-326 (2004).</li>
<li>Xu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+physical+mapping+from+large-insert+clones+by+fingerprint+analysis+with+capillary+electrophoresis%3A+a+robust+physical+map+of+Penicillium+chrysogenum%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Genome physical mapping from large-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis: a robust physical map of Penicillium chrysogenum.</a> Nucleic Acids Res. 33 (5), e50(2005).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+physical+mapping+of+polyploids%3A+a+BIBAC+physical+map+of+cultivated+tetraploid+cotton%2C+Gossypium+hirsutum+L%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genome physical mapping of polyploids: a BIBAC physical map of cultivated tetraploid cotton, Gossypium hirsutum L.</a> PLoS One. 7 (3), e33644(2012).</li>
<li>Frary, A., Hamilton, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+and+stability+of+high+molecular+weight+DNA+transformation%3A+An+analysis+in+tomato%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Efficiency and stability of high molecular weight DNA transformation: An analysis in tomato.</a> Transgenic Res. , (2001).</li>
<li>Stam, M., Viterbo, A., Mol, J. N. M., Kooter, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Position-Dependent+Methylation+and+Transcriptional+Silencing+of+Transgenes+in+Inverted+T-DNA+Repeats%3A+Implications+for+Posttranscriptional+Silencing+of+Homologous+Host+Genes+in+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Position-Dependent Methylation and Transcriptional Silencing of Transgenes in Inverted T-DNA Repeats: Implications for Posttranscriptional Silencing of Homologous Host Genes in Plants.</a> Cell Biol. 18 (11), 6165-6177 (1998).</li>
<li>Głowacka, K., Kromdijk, J., Leonelli, L., Niyogi, K. K., Clemente, T. E., Long, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+new+and+established+methods+to+determine+T-DNA+copy+number+and+homozygosity+in+transgenic+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Environ%22%5BJournal%5D)">An evaluation of new and established methods to determine T-DNA copy number and homozygosity in transgenic plants.</a> Plant Cell Environ. 39 (4), 908-917 (2016).</li>
<li>Stefano, B., Patrizia, B., Matteo, C., Massimo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inverse+PCR+and+Quantitative+PCR+as+Alternative+Methods+to+Southern+Blotting+Analysis+to+Assess+Transgene+Copy+Number+and+Characterize+the+Integration+Site+in+Transgenic+Woody+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Genet%22%5BJournal%5D)">Inverse PCR and Quantitative PCR as Alternative Methods to Southern Blotting Analysis to Assess Transgene Copy Number and Characterize the Integration Site in Transgenic Woody Plants.</a> Biochem Genet. 54 (3), 291-305 (2016).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano senza concorrenti interessi finanziari o altri conflitti di interesse.

Critica alla generazione transgenica con integrazioni singoli, intatti di un transgene è la scelta del vettore binario utilizzato. Vettori di famiglia BIBAC sono stati utilizzati per fornire sequenze di interesse a molti pianta specie23,24,25,26,27,28. Vettori di BIBAC, tra cui BIBAC-GW, resa singola copia integrazioni con al...

Durante la generazione di piante transgeniche, solitamente l'obiettivo è di avere il transgene(s) integrato stabilmente espressa. Questo può essere ottenuto integrazioni intatto copia singola di un transgene. Più integrazioni possono portare all'espressione aumentata di un transgene, ma anche al silenziamento genico. Silenziamento dei transgeni è più probabile se sequenze inserite sono disposti in tandem o ripetizioni invertito1,2,3,4. Vettori binari vengono utilizzati come navette in Agrobacterium-mediata esperimenti di trasformazione per consegnare le sequenze di interesse in genomi delle piante. Il numero di integrazioni in un genoma della pianta è dipenda dal numero di copia del vettore binario in Agrobacterium tumefaciens5,6. Molti vettori binari comunemente utilizzati sono vettori di alta copia e pertanto generare un numero di copie del transgene medio alta: 3.3-4.9 copie in Arabidopsis5.
Il numero delle integrazioni T-DNA può essere abbassato utilizzando vettori binari che hanno un numero di basso-copia di a. tumefaciens, ad esempio BIBAC7, o con il lancio di un T-DNA a. tumefaciens del cromosoma5. Il numero medio di integrazioni del transgene in tali casi è inferiore a 25,8,9,10. A causa di essere copia singola in a. tumefaciens e anche in Escherichia coli, BIBAC-derivati possono mantenere e consegnare costrutti grande come 150 kb11.
GW-compatibile BIBAC vettori10,12 permetterne la facile introduzione di geni di interesse nel vettore utilizzando Gateway clonazione. L'uso della tecnologia Gateway semplifica notevolmente la procedura di clonazione, ma supera anche i problemi più comuni associati con grandi vettori low-copy-number13,14, come un basso rendimento del DNA e una selezione limitata di unica restrizione siti disponibili per la clonazione7,11. I derivati di pBIBAC-GW sono disponibili con una resistenza al glufosinato-ammonio (pBIBAC-BAR-GW) o DsRed fluorescenza in tegumenti (pBIBAC-RFP-GW) per la selezione di piante (Figura 1)10,12. Per entrambi i vettori, un gene di resistenza alla kanamicina viene utilizzato come indicatore di selezione nei batteri.
Combinano i vettori pBIBAC-GW: (1) facile progettazione e manipolazione genetica in e. colie (2) intatto copia singola integrazioni in planta ad alta efficienza. Il rendimento dei vettori pBIBAC-GW integrazioni media 1.7 in Arabidopsis con circa la metà delle piante transgeniche che trasportano un singolo integrato T-DNA10.
Stabile espressione dei transgeni è un requisito per la maggior parte transgenetica generato. L'espressione del transgene stabile può essere ottenuta integrazioni intatti, singola copia. Lavorare con piante transgeniche che trasportano integrazioni intatti, copia singola è, tuttavia, ancora più importante se, ad esempio, lo scopo è lo studio dell'efficienza dei processi basati su cromatina, come mutagenesi, ricombinazione, o la riparazione e la dipendenza di questi processi sulla posizione genomica e struttura della cromatina, al sito di inserimento. Per il nostro interesse, per studiare la dipendenza di mutagenesi oligonucleotide diretto (ODM) sul contesto locale di genomico, un insieme di linee di reporter con integrazioni intatti, singola copia di un gene del reporter di mutagenesi era generato (Figura 2)10. Utilizzando questo set di righe, è stato dimostrato che l'efficienza ODM varia tra i loci transgenici integrati in differenti luoghi genomic, nonostante i livelli di espressione del transgene essendo piuttosto simile.

<table><tbody><tr><td>Kanamicina solfato monoidrato</td><td>Duchefa</td><td>K0126</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina solfato</td><td>Duchefa</td><td>G0124</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Duchefa</td><td>R0146</td><td></td></tr><tr><td>Tetraciclina cloridrato</td><td>Sigma</td><td>T-3383</td><td></td></tr><tr><td>DB3.1 cellule competenti</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11782-018</td><td>One Shot ccdB Survival 2 cellule competenti T1R (A10460) di Invitrogen o qualsiasi altro ceppo E. coli resistente al ccdB può essere utilizzato in alternativa... &nbsp;</td></tr><tr><td>DH10B cellule competenti</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>18290-015</td><td></td></tr><tr><td>Gateway LR clonasi miscela di enzimi&nbsp;</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>11791-019</td><td></td></tr><tr><td>citrato trisodico diidrato</td><td>Merck</td><td>106432</td><td></td></tr><tr><td>base Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodico diidrato</td><td>Duchefa</td><td>E0511</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>EO0491</td><td></td></tr><tr><td>Bacto triptone</td><td>BD</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Honeywell Fluka</td><td>13423</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Merck</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosio monoidrato</td><td>Merck</td><td>108346</td><td></td></tr><tr><td>Cuvette per elettroporazione, 0,1 cm di distanza</td><td>Biorad</td><td></td><td></td>1652089</tr><tr><td>Electroporator Gene Pulser</td><td>BioRad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Calbiochem</td><td>442613</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Maltosio monoidrato 90%</td><td>Acros Organics</td><td>32991</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0138454</td><td></td></tr><tr><td>Murashige Skoog medium</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Glufosinato-ammonio (Basta)</td><td>Bayer</td><td>79391781</td><td></td></tr><tr><td>Enzimi di restrizione</td><td>NEB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Bio-Rad</td><td>1610433</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di elettroforesi</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Idrossido</td> <td>di sodioMerck</td><td>106498</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Merck</td><td>100316</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in nylon assorbente Hybond N+</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15358</td><td>o GE Healthcare Life Sciences (RPN203B)</td></tr><tr><td>Whatman 3MM Chr carta assorbente</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3030-931</td><td></td></tr><tr><td>dNTP</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0181</td><td></td></tr><tr><td>Acetilato BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B2518</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Merck</td><td>805740</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-50 Coarse</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17004401</td><td>o Sephadex G-50 Medium (17004301)</td></tr> <tr><td>Destrano solfato sale sodico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8906</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Dodecil solfato&nbsp;</td><td>US Biological</td><td>S5010</td><td></td></tr><tr><td>Salmon Sperm DNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>Sodio diidrogeno fosfato monoidrato</td><td>Merck</td><td>106346</td><td></td></tr><tr><td>Storage Schermo al fosforo e casette</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>28-9564-74</td><td></td></tr><tr><td>Imager al fosforo</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>Typhoon FLA 7000</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker</td><td>Stratagene</td><td>Stratalinker 1800</td><td></td></tr><tr><td>pellicola trasparente (Saran wrap)</td><td>Omnilabo</td><td>1090681</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Thermo Scientific - Invitrogen</td><td>16500</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Merck</td><td>100165</td><td></td></tr><tr><td>marcatore di DNA' Blauw'; Scala del DNA.</td><td>MRC Holland</td><td>MCT8070</td><td></td></tr><tr><td>marcatore del DNA ' Rood'; Scala DNA</td><td>MRC Holland</td><td>MCT8080</td><td></td></tr><tr><td>Mix di esanucleotidi</td><td>Roche</td><td>11277081001</td><td></td></tr><tr><td>Kit di grandi dimensioni</td><td>Qiagen</td><td>12462</td><td></td></tr><tr><td>Tubo in polietilene termosaldabile, chiaro</td><td>vari fornitori</td><td></td><td>la larghezza del tubo deve essere più ampia di quella della membrana assorbente</td></tr><tr><td>Termosigillante</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtro a membrana disco</td><td>Merck</td><td>VSWP02500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Merck</td><td>105833</td><td></td></tr><tr><td>Rete di ibridazione</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>RPN2519</td><td></td></tr></tbody></table>

generazione di piante transgeniche con inserimenti di copia singola utilizzando il vettore binario bibac-gw

Generating Transgenic Plants with Single-copy Insertions Using BIBAC-GW Binary Vector

Durante la generazione di piante transgeniche, generalmente l'obiettivo è di avere espressione stabile di un transgene. Questo richiede una singola, intatta l'integrazione del transgene, come multi-copia integrazioni sono spesso sottoposti al silenziamento genico. Il vettore binario compatibile con Gateway basato su cromosomi artificiali batterici (pBIBAC-GW), come altri derivati pBIBAC, permette l'inserimento di transgeni copia singola con alta efficienza. Come un miglioramento per il pBIBAC originale, una cassetta di Gateway è stata clonata in pBIBAC-GW, così che le sequenze di interesse possono ora essere facilmente incorporate nel transfer vettoriale DNA (T-DNA) mediante la clonazione di Gateway. Comunemente, la trasformazione con pBIBAC-GW si traduce in un'efficienza pari a 0,2 – 0,5%, per cui la metà della transgenetica trasportare un'integrazione di singola copia intatta del T-DNA. I vettori di pBIBAC-GW sono disponibili con resistenza al glufosinato-ammonio o DsRed fluorescenza in cappotti di seme per la selezione di piante e con resistenza alla kanamicina come una selezione nei batteri. Qui, una serie di protocolli è presentata che guida il lettore attraverso il processo di generazione di piante transgeniche utilizzando pBIBAC-GW: a partire da ricombinando le sequenze di interesse nel vettore pBIBAC-GW di scelta, di piantare trasformazione con Agrobacterium, selezione della transgenetica e prova le piante per integrità e copia il numero degli inserti utilizzando DNA macchiare. Attenzione viene data alla progettazione di una strategia di blotting di DNA riconoscere single - e multi - copia integrazioni ai loci singoli e multipli.

Utilizzando il sistema di BIBAC-GW, costruzioni del reporter per studiare ODM in piante erano generati10. Costrutti sono stati progettati nella voce Gateway vettoriale pENTR-gm12 e inseriti nel pBIBAC-BAR-GW (Figura 1) usando la reazione di ricombinazione LR Gateway.
Arabidopsis sono stati trasformati con pDM19, un plasmide BIBAC-BAR-GW con un reporter...

Utilizzando un vettore binario pBIBAC-GW rende generando piante transgeniche con inserimenti di singola copia intatti, un processo facile. Qui, una serie di protocolli è presentata che guida il lettore attraverso il processo di generazione di piante transgeniche di Arabidopsis e prova le piante per integrità e copiare il numero degli inserti.

Generazione di piante transgeniche con inserimenti di copia singola utilizzando il vettore binario BIBAC-GW

When generating transgenic plants, generally the objective is to have stable expression of a transgene. This requires a single, intact integration of the ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di generare piante transgeniche che trasportano inserzioni intatte e a copia singola di un DNA di trasferimento, o T-DNA, in modo efficiente. Il vettore BIBAC-Gateway è uno strumento prezioso per generare piante transgeniche che trasportano inserzioni intatte e a copia singola di sequenze di interesse che mostrano un'espressione genica stabile. Con il vettore BIBAC-Gateway, è possibile utilizzare la tecnologia di ricombinazione Gateway per inserire sequenze di interesse con il minimo sforzo.Tutti i derivati BIBAC, compresi i vettori BIBAC-Gateway, sono adatti per il trasferimento di grandi frammenti di DNA transgenico nei genomi delle piante. I vettori BIBAC-GW possono essere utilizzati per inserire sequenze di interesse in molti sistemi vegetali, come mais, riso e pomodoro. Sono disponibili due plasmidi BIBAC-GW.Il plasmide BIBAC-RFP-GW contiene un gene DsRed che è espresso nei rivestimenti dei semi. Il plasmide BIBAC-BAR-GW contiene un gene che fornisce resistenza al glufosinato. Entrambi i vettori contengono un gene resistente alla kanamicina come marcatore di selezione nei batteri.Per inserire le sequenze di interesse nel vett

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In questo video, dimostriamo la generazione di piante transgeniche di Arabidopsis che esprimono un transgene stabile attraverso la trasformazione genica basata su cromosomi artificiali batterici binari mediata da Agrobacterium.

Trasformazione genica basata su vettori cromosomici artificiali batterici binari nelle piante di Arabidopsis: una tecnica per generare piante transgeniche con inserimento a copia singola

L'agroinfiltrazione e l'agroinfezione PVX sono test funzionali di routine per l'espressione ectopica transitoria dei geni nelle piante. Questi metodi sono test efficienti nelle strategie di effettioromica (rapida resistenza e scoperta del gene dell'avirulenza) e cruciali per la moderna ricerca nella patologia vegetale molecolare. Soddisfano la domanda di solide analisi funzionali ad alta produttività negli impianti.

Agroinfiltrazione e Agroinfezione PVX in Benthamiana di Patate e Nicotiana

Questo lavoro descrive un nuovo metodo per selettivamente organelli subcellulari nelle piante, saggiata usando l'BioRad Gene Gun.

Transient espressione genica in tabacco con all&#39;Assemblea Gibson e Gene Gun

Le metodologie di targeting genico possono essere utilizzate per generare topi transgenici con alleli knockout, knock-in e marcati.  Qui, descriviamo un metodo migliorato di ricombinazione in E. coli, che chiamiamo "subclonaggio più inserimento", che può essere utilizzato per generare rapidamente vettori di targeting genico personalizzati.

Subcloning più Insertion (SPI) - A Novel Metodo recombineering per la costruzione rapida di gene targeting Vettori

Qui, vi presentiamo un protocollo per trasformare il lino con Agrobacterium trasformazione dell'impianto mediata tramite floreale-dip. Questo protocollo è semplice da eseguire e poco costoso, ma produce un tasso trasformazione superiori alle attuali metodi disponibili per la trasformazione di lino.

Trasformazione Floral-Dip di lino ( Linum usitatissimum) Per generare transgenici progenie con una trasformazione Tasso alta

Utilizzando assemblaggio DNA, vettori multipli CRISPR possono essere costruiti in parallelo in una singola reazione clonazione, rendendo la costruzione di un gran numero di CRISPR vettori un compito semplice. Pomodoro radici pelose sono un sistema eccellente modello per convalidare vettori CRISPR e generare materiali mutanti.

High-throughput CRISPR vettore Costruzione e caratterizzazione di modifiche del DNA da Generazione di Roots pomodoro Peloso

Qui, presentiamo un metodo per la generazione di sistemi di trascrizione binario tessuto-specifici in Drosophila , sostituendo il primo esone codifica dei geni con driver di trascrizione. Il metodo basato su CRISPR/Cas9 inserisce una sequenza di transactivator ai sensi del regolamento endogeno di un gene sostituito e di conseguenza facilita transctivator espressione esclusivamente in reticoli spatiotemporal gene-specifico.

Una strategia efficace per la generazione di sistemi di trascrizione binario tessuto-specifici in Drosophila genoma modificando

Qui, presentiamo i protocolli per l'utilizzazione del insetto cella e baculovirus proteina espressione sistema per produrre grandi quantità di proteine vegetali secernuta per cristallizzazione della proteina. Un vettore di espressione di baculovirus è stato modificato con GP67 o insetto hemolin peptide di segnale per espressione di secrezione della proteina vegetale in cellule di insetto.

Modifica di vettori di espressione di Baculovirus per produrre secreti proteine vegetali nelle cellule di insetto

Qui, descriviamo la generazione e applicazione di un insieme di transgeniche di Arabidopsis thaliana linee espressione inducibile, tessuto-specifica abilitazione in tre meristemi principali, il meristema apicale di sparare, radice meristema apicale e il cambio.

Viscoelastica, espressione di tipo specifico delle cellule in Arabidopsis thaliana attraverso LhGR-mediata Trans-attivazione

La trasformazione germinale di successo nel verme dell'esercito autunnale, Spodoptera frugiperda,è stata ottenuta utilizzando l'mRNA della trasposasi iperattiva piggyBac.

Piggy iperattivoTrasponsi-mediata dalla trasposizione della linea germinale nel verme dell'esercito autunnale, Spodoptera frugiperda

Qui, descriviamo un protocollo per la generazione di mutanti materni che accoppia una linea di knock-in stabile zpc:cas9 con la consegna mediata da Tol2 di cassette di espressione di sgRNA.

Generazione di mutanti materni utilizzando zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

Impara a generare piante transgeniche con inserimenti di copia singola integri utilizzando il vettore binario BIBAC-GW. Questo metodo facilita la creazione efficiente di piante Arabidopsis stabili.

Generazione di piante transgeniche con inserimenti di copia singola utilizzando il vettore binario BIBAC-GW

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