Generazione di piante transgeniche con inserimenti di copia singola utilizzando il vettore binario BIBAC-GW

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di generare piante transgeniche che trasportano inserzioni intatte e a copia singola di un DNA di trasferimento, o T-DNA, in modo efficiente. Il vettore BIBAC-Gateway è uno strumento prezioso per generare piante transgeniche che trasportano inserzioni intatte e a copia singola di sequenze di interesse che mostrano un'espressione genica stabile. Con il vettore BIBAC-Gateway, è possibile utilizzare la tecnologia di ricombinazione Gateway per inserire sequenze di interesse con il minimo sforzo.

Tutti i derivati BIBAC, compresi i vettori BIBAC-Gateway, sono adatti per il trasferimento di grandi frammenti di DNA transgenico nei genomi delle piante. I vettori BIBAC-GW possono essere utilizzati per inserire sequenze di interesse in molti sistemi vegetali, come mais, riso e pomodoro. Sono disponibili due plasmidi BIBAC-GW.

Il plasmide BIBAC-RFP-GW contiene un gene DsRed che è espresso nei rivestimenti dei semi. Il plasmide BIBAC-BAR-GW contiene un gene che fornisce resistenza al glufosinato. Entrambi i vettori contengono un gene resistente alla kanamicina come marcatore di selezione nei batteri.

Per inserire le sequenze di interesse nel vettore binario, preparare prima la voce Gateway e i vettori binari, come descritto nel protocollo di testo. Per eseguire una reazione Gateway, preparare la reazione di ricombinazione LR secondo i suggerimenti del fornitore in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri a temperatura ambiente. Mescolare da 100 a 300 nanogrammi del clone Entry superavvolto e 300 nanogrammi del vettore BIBAC-Gateway.

Regolare il volume della miscela a 16 microlitri con TE. Infine, aggiungere quattro microlitri di miscela di enzimi LR Clonasi e mescolare a vortice. Incubare la miscela a 25 gradi Celsius per un'ora. Terminare la reazione LR aggiungendo due microlitri di soluzione di proteinasi K alla miscela.

Mescolare e incubare a 37 gradi Celsius per 10 minuti prima di procedere con la trasformazione in E.coli, come descritto nel protocollo di testo. Per preparare le piante di Arabidopsis alla trasformazione, coltiva le piante di Arabidopsis in una serra o in una camera di crescita a clima controllato fino alla fioritura. Aggancia i primi bulloni per consentire l'emergere di più bulloni secondari.

Le piante sono pronte per l'immersione da quattro a sei giorni dopo la tosatura, quando le piante hanno molti capolini immaturi e non molte silique fecondate. Per eseguire l'immersione floreale, immergere le infiorescenze per cinque-10 secondi in sospensione di Agrobacterium. Usa un'agitazione delicata.

Avvolgi le parti fuori terra delle piante nella pellicola trasparente per mantenere alta l'umidità e copri i vasi delle piante con una scatola per mantenere le piante al buio. Incubare le piante per due giorni in una serra o in una camera di crescita. Dopo due giorni, rimuovi la scatola e la pellicola trasparente e fai crescere le piante fino alla maturità in una serra o in una camera di crescita.

Per aumentare l'efficienza della trasformazione, le stesse piante possono essere riimmerse sette giorni dopo la prima immersione. Successivamente, quando le piante trasformate sono mature e secche, raccogli i semi. Raggruppa e analizza i semi delle piante trasformate con lo stesso costrutto in un unico set.

Nel caso in cui le piante vengano trasformate con un derivato plasmidico BIBAC-RFP-Gateway, identificare le piante transgeniche analizzando i semi utilizzando la microscopia a fluorescenza. Per rilevare l'espressione di DsRed nei rivestimenti dei semi, è necessario visualizzare i semi con un'eccitazione di 560 nanometri e un'emissione da 600 a 650 nanometri. Separare i semi fluorescenti dalle controparti non fluorescenti usando una pinza.

Per lo screening delle piante transgeniche trasformate con un derivato plasmidico BIBAC-BAR-Gateway, seminare i semi in vassoi pieni di terra. Garantire una distribuzione uniforme dei semi sui vassoi sospendendo i semi in agar allo 0,1% in un terreno 0,5x MS e distribuire i semi utilizzando una pipetta da un millilitro. Stimola i semi a germogliare in modo sincrono incubando i semi per almeno due giorni a quattro gradi Celsius.

Questo può essere fatto prima o dopo la semina. Due e tre settimane dopo la semina, spruzzare le piantine con una soluzione di glufosinato-ammonio allo 0,5%. Utilizzare 500 millilitri di soluzione di glufosinato-ammonio per un metro quadrato.

Trasferisci le piantine sopravvissute in vaso. Analizzare le piante resistenti al glufosinato-ammonio mediante PCR per la presenza del costrutto di interesse. Determinare il numero di integrazioni di T-DNA e la loro integrità mediante blotting del DNA utilizzando enzimi di restrizione.

Questo metodo consente l'identificazione di integrazioni singole e ripetute nello stesso loco o in loci diversi nel genoma. Utilizzare una serie di digestioni di restrizione per identificare i diversi modelli di integrazione possibili. Selezionare un enzima che taglia una volta al centro del T-DNA, per essere in grado di sondare in modo indipendente le sequenze a monte e a valle del sito di restrizione.

Inoltre, seleziona un enzima o una combinazione di enzimi tagliando l'intera sequenza di interesse in una sola volta. Fare attenzione a utilizzare solo enzimi di restrizione che non sono sensibili alla metilazione della citosina. Dopo aver eseguito il blotting del DNA, come descritto nel protocollo di testo, eseguire l'analisi del blot.

L'analisi dipende dalla strategia di restrizione utilizzata. Quando si analizza il blot utilizzando la strategia con un sito di restrizione al centro del T-DNA, contare il numero di frammenti rilevati. In questa strategia, il numero di frammenti ibridati suggerisce il numero di integrazioni di T-DNA.

Confrontare il numero di frammenti rilevati con una sonda per il lato sinistro e destro del T-DNA. Se viene rilevato un numero diverso di frammenti ibridanti con le due sonde, sono presenti più integrazioni di T-DNA in una ripetizione invertita o T-DNA non completamente integrati. Per identificare le disposizioni tandem e invertite dei T-DNA, stimare le dimensioni dei frammenti ibridanti sul blot in base alla dimensione delle bande marcatrici e confrontare le dimensioni stimate con le dimensioni previste dei frammenti calcolate in base alla strategia di restrizione.

Per esaminare se la sequenza transgenica di interesse è intatta, analizzare il blot preparato secondo la strategia con siti di restrizione alle estremità della sequenza di interesse. Stimare la dimensione dei frammenti ibridanti sul blot in base alla dimensione delle bande marcatrici e confrontarla con la dimensione prevista. Un inserimento intatto produce un singolo frammento con una lunghezza definita.

Qualsiasi deviazione dalla lunghezza prevista indica un'integrazione incompleta. Viene mostrata la strategia di restrizione e blotting del DNA per determinare il numero e l'integrità delle integrazioni del T-DNA. Il sito di restrizione ScaI divide la sequenza reporter nelle parti prossimali del bordo sinistro che vengono rilevate quando si utilizza una sonda per barra e nelle parti prossimali del bordo destro che vengono rilevate quando si utilizza una sonda per eYFP.

I siti di restrizione BglII e PciI sono posizionati all'interno del T-DNA, al di fuori del costrutto reporter. Una doppia digestione si traduce in un frammento con una dimensione definita e qualsiasi deviazione è un'indicazione di inserimenti incompleti. Il numero di frammenti ibridanti identificati riflette il numero di inserzioni di T-DNA.

Un blot contenente DNA genomico di nove transgenici digeriti con ScaI è stato ibridato con sonde per bar ed eYFP. Diverse corsie indicano transgenici con singole integrazioni di T-DNA. La corsia quattro visualizza due frammenti con barra e uno con eYFP, che indicano un troncamento della sequenza eYFP o una ripetizione invertita attorno al bordo destro.

La corsia sei mostra due frammenti con la barra e l'eYFP. Un frammento ha un'intensità debole con la sonda a barra. L'altro frammento ha un'alta intensità, indicando due inserzioni di T-DNA, una delle quali è troncata.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come incorporare la tua sequenza di DNA di interesse in un vettore binario BIBAC-GW utilizzando la ricombinazione Gateway, seguita dalla trasformazione di Arabidopsis, dallo screening e dalla valutazione del numero di integrazioni di T-DNA e della loro integrità. La generazione e la caratterizzazione di piante transgeniche richiede molto tempo. Quando si utilizza BIBAC-Gateway come vettore binario, il processo di identificazione dei transgenici con integrazioni intatte e a copia singola può essere abbreviato.

Circa la metà dei transgenici generati con derivati BIBAC porta integrazioni intatte a copia singola. In generale, gli individui non si rendono conto che molte piante transgeniche generate utilizzando vettori binari comuni portano copie troncate di un transgene o di transgeni che mostrano il silenziamento genico. Con i derivati BIBAC, la maggior parte delle piante transgeniche generate porta intatte singole integrazioni di un transgene che raramente mostrano il silenziamento genico.

Quando si utilizza BIBAC-GW per la generazione di transgenici, è importante trasformare un numero sufficiente di materiali vegetali, poiché l'efficienza di trasformazione complessiva dei derivati BIBAC è inferiore a quella dei vettori binari comunemente usati. L'efficienza di trasformazione di BIBAC-GW è generalmente compresa tra lo 0,2% e lo 0,5%Dopo aver identificato piante transgeniche che portano integrazioni di T-DNA intatte e a copia singola, se necessario, possono essere eseguite ulteriori analisi per definire la precisa posizione genomica dell'inserzione del T-DNA. I transgenici con integrazioni intatte a copia singola mostrano livelli di espressione comparabili dei transgeni.

Ciò indica che la posizione di integrazione del T-DNA nel genoma ha scarso effetto sul livello di espressione del transgene.