Site-specific Ingegneria batterica Cromosoma: ΦC31 integrasi Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Un metodo rapido ed efficace per integrare DNA estraneo di interesse in pre-fatti ceppi accettori, chiamati ceppi pista di atterraggio, è descritta. Il metodo permette integrazione sito-specifica di una cassetta DNA nel locus ingegnerizzato atterraggio di un dato ceppo, tramite coniugazione e l'espressione del ΦC31 integrasi.

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di integrare un costrutto di DNA desiderato nel cromosoma batterico in un locus predeterminato. Ciò si ottiene grazie a un protocollo di accoppiamento che coinvolge quattro ceppi batterici ingegnerizzati. Il ceppo ricevente ha una sequenza di piattaforma di atterraggio costituita da un gene di resistenza alla micina e dal gene della beta glucuronidasi di e coli affiancato da siti di ATP integrati nel suo cromosoma.

Il ceppo donatore P JH one 10 trasporta un plasmide contenente nei siti B che fiancheggia un gene della proteina fluorescente rossa e un gene di resistenza agli antibiotici. Il ceppo donatore PJC two trasporta un plasmide contenente l'integrasi sito-specifica del fago C 31 dello streptomyces sotto il controllo del promotore LAC. Il quarto ceppo, MT 616, fornisce i geni di trasferimento necessari per la coniugazione: il trasferimento di plasmidi da cellula a cellula, provoca la creazione di trans attraverso i ceppi riceventi.

Acquisizione dei due plasmidi necessari per lo scambio di cassette mediato dall'integrasi. Lo scambio della cassetta donatrice dal plasmide PJ H one 10 con i marcatori della cassetta della piattaforma di atterraggio sul cromosoma provoca la perdita dei marcatori della piattaforma di atterraggio, SPR e UIDA e il mantenimento della cassetta donatrice RFP e GMR nel trans immigrato risultante. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ad altri metodi come la ricombinazione omologa è la facilità e l'efficienza del protocollo.

È anche trasferibile a una vasta gamma di batteri. Il ceppo accettore utilizzato in questo video è un ceppo S milli latte due giorni prima della procedura di accoppiamento per la creazione di trans integrine inoculare da una singola colonia in cinque millilitri di terreno TY con micina spettale incubare il ceppo S milli a 30 gradi Celsius per due giorni con agitazione il giorno prima della procedura di accoppiamento inoculare ciascuno dei seguenti ceppi di e coli in cinque millilitri di terreno liquido LB integrato con l'antibiotico appropriato DH cinque alfa contenente il plasmide di espressione dell'integrasi in terreno con tetraciclina MT 616, l'intermedio mobilizzatore con cloramfenicolo e DH cinque alfa contenente il plasmide a cassetta del donatore in terreno con gentamicina, incubare i tre ceppi di e Coli durante la notte a 37 gradi Celsius con agitazione costante per preparare le cellule per la procedura di accoppiamento. Trasferire 1,5 millilitri di ciascuna delle quattro colture in una provetta e centrifugare a 17.000 volte G per 30 secondi per raccogliere il pellet cellulare, scartare il terreno e risospendere ogni pellet cellulare in un millilitro di cloruro di sodio sterile allo 0,85% centrifugare nuovamente le provette dopo aver scartato il surnatante Resus sospendere ogni pellet in 100 microlitri di cloruro di sodio sterile allo 0,85% utilizzando una pipetta individuare singolarmente 10 microlitri di coltura lavata per ciascuno filtrare su una piastra di agar TY liscia.

Questi punti sono punti di controllo. Successivamente, aggiungere 40 microlitri di ciascun ceppo, escludendo l'e coli DH five alpha contenente Pjc due in una provetta sterile e miscelato pipettando su e giù 120 microlitri di questa miscela sulla piastra di agar TY semplice. Questo punto è il controllo negativo senza integrasi.

Infine, aggiungere 40 microlitri di ciascuno dei quattro ceppi in una miscela di provette sterili e spot. 160 microlitri di questa miscela sulla stessa piastra di agar TDY. Questo punto è il punto di accoppiamento a scambio di cassette mediato dall'integrasi.

Posizionare la piastra in una cappa a flusso laminare e lasciare asciugare le macchie per circa 20 minuti. Sigillare la piastra e incubare a 30 gradi Celsius durante la notte del giorno dopo la serie del protocollo di accoppiamento. I due punti di controllo e il punto di accoppiamento IMCE su piastre di agar TY integrate con streptomicina e gentamicina.

Il ceppo S milli accettore porta una mutazione che conferisce un alto livello di resistenza alla streptomicina per il calcolo dell'efficienza IMCE Resus sospendere circa un quarto del punto di accoppiamento IMCE in 500 microlitri di cloruro di sodio sterile 0,85% fare diluizioni seriali dieci volte a 10 alla settima piastra negativa Le diluizioni tendono al negativo due attraverso 10 al cinque negativo su piastre di agar TY integrate con streptomicina, gentamicina e xGL per selezionare gli immigrati trans. Le diluizioni delle piastre tendono da tre a 10 negative a sette negative su piastre di agar TY, integrate con streptomicina e xgl per selezionare sia gli immigrati trans che i potenziali riceventi. I riceventi totali IE incubano le piastre a 30 gradi Celsius per tre giorni.

Visualizza RFP trans sotto la luce verde e attraverso un filtro rosso calcola la percentuale di efficienza IMCE come CFU degli immigrati trans rispetto ai CFU dei destinatari totali, circa la metà dei trans avrà subito un vero scambio rendendoli bianchi e insensibili dopo tre giorni di incubazione su Ty integrato con streptomicina e gentamicina, non dovrebbe esserci crescita nei seguenti ceppi di controllo, nessun controllo dell'integrasi s milli latte UW 2 27 controllo e coli MT 616 controllo e coli DH cinque alfa contenente P JH uno 10 controllo e e coli DH cinque alfa contenente PJC due controlli. Al contrario, la striscia IMCE dal punto di accoppiamento dovrebbe avere una crescita confluente sulla striscia della testa e molte colonie sulla seconda striscia. Queste due immagini successive mostrano sospensioni di un 10 alla diluizione negativa di due del punto di accoppiamento su TY streptomicina xgl agar e su TY streptomicina gentamicina xgl agar sulla streptomicina TY gentamicina xgl agar.

Le colonie blu sono singoli ricombinanti. Mentre le colonie bianche sono integrine trans che hanno subito un vero scambio di cassette se osservate sotto la luce verde e attraverso un filtro rosso, tendono alla diluizione negativa di due della sospensione di repus del punto di accoppiamento su TY strept cin xgl agar manca di fluorescenza. Al contrario, la diluizione da 10 a meno due della sospensione di reus del punto di accoppiamento su Ty streptomicina Gentamicina Xgl Agar mostra due livelli di fluorescenza.

Le colonie più luminose corrispondono alle colonie blu e hanno una maggiore espressione di RFP, presumibilmente a causa della promozione di una lettura dal promotore LAC nel vettore. Le colonie meno luminose corrispondono alle colonie bianche, che hanno subito un vero scambio di cassette e contengono RFP con solo il suo promotore immediato e nessuna lettura dal promotore LAC. Questi immigrati di tendenza dovrebbero anche essere macchioline sensibili alla micina.

L'efficienza dell'integrazione trans espressa come percentuale di immigrati trans rispetto al totale dei riceventi dovrebbe essere nell'ordine dello 0,5%Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la coniugazione batterica utilizzando i nostri ceppi ingegnerizzati per inserire costrutti di DNA nel cromosoma batterico.