Name: Site-specific Ingegneria batterica Cromosoma: ΦC31 integrasi Mediated Cassette Exchange (IMCE) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-03-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Impara l'integrazione sito-specifica del DNA nei cromosomi batterici utilizzando la tecnica IMCE con ΦC31 integrasi e coniugazione. Questo metodo efficiente consente modifiche genetiche precise in diversi ceppi microbici.

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Per CM Margaret Smith per aver gentilmente fornire il clone integrasi Un sostegno finanziario a partire da: Genome Canada / Genome Prairie NSERC Discovery e borse di studio progetti strategici

1. Produzione di Cultura <ol><li> Preparare liquidi sterili: TY 10 (5 g / l triptone, 3 g / l di estratto di lievito, 0,44 g / l di cloruro di calcio diidrato), e LB 11 (10 g / l triptone, 5 g / l di estratto di lievito, 5 g / cloruro di sodio, pH 7). </li><li> Inoculare da una singola colonia: SmUW227 (S. meliloti LP-ceppo: verranno descritte altrove, ceppo dettagli costruttivi disponibili su richiesta) () in 5 ml di TY media con 50 ug / ml spectinomicina. Inoculare le seguenti ceppi in 5 ml di liquidi LB, che integra con l&#39;antibiotico data: E. coli DH5a 12 contenente pJC2, il plasmide di espressione integrasi, con 10 pg / ml di tetraciclina; E. coli MT616 13, il mobilizzatore, con 10 pg / ml cloramfenicolo, e E. coli DH5a contenente pJH110, la cassetta plasmide donatore, con 5 pg / ml di gentamicina. </li><li> Incubare E. ceppi di E. notte a 37 &amp;deg; C con costante agitazione. Incubare S. meliloti deformazione a 30 ° C per due giorni con agitazione. È possibile ottenere una S. meliloti cultura per tutta la notte con un inoculo più grande (1:500 sottocultura di una cultura satura). </li></ol> 2. Cultura preparazione e miscelazione <ol><li> Lavare 1,5 ml di coltura di ciascun ceppo raccogliendo il pellet cellulare mediante centrifugazione a 17.000 xg per 30 secondi e risospeso in 1 ml di NaCl sterile 0,85%; ripetere una volta. </li><li> Risospendere il pellet in 100 microlitri di sterile allo 0,85% NaCl. </li><li> Individualmente individuare 10 pl della cultura lavato per ogni ceppo su una pianura piastra di agar TY. Questi punti sono punti di controllo. </li><li> Aggiungere 40 pl di ciascun ceppo esclusa la E. coli DH5a 12 contenente pJC2 in una provetta sterile, mescolare, e spot 120 microlitri di questa miscela in una pianura piastra di agar TY. Questo punto è il no-integrasi controllo negativo. </li><li> Aggiungere 40 pl di ciascun ceppo in un t sterileUbe, mix, e spot 160 microlitri di questa miscela in una pianura piastra di agar TY. Questo luogo è il punto di accoppiamento IMCE. </li><li> Lasciare punti asciugare in una cappa a flusso laminare. </li><li> Piastre di tenuta e incubare a 30 ° C per una notte. </li></ol> 3. Isolamento di Trans-integrants <ol><li> Punti di controllo Streak e spot IMCE su piastre di agar TY integrato con 200 mg / ml di streptomicina (SmUW227 si basa su Rm1021 che trasporta una mutazione conferisce resistenza di alto livello alla streptomicina 14) e 30 mg / ml di gentamicina. </li><li> Per il calcolo del rendimento IMCE, risospendere circa ¼ del punto di accoppiamento IMCE in 500 microlitri sterile NaCl allo 0,85%. Effettuare diluizioni seriali di 10 volte a 10 -7. Piatto diluizioni 10 -2 a 10 -5 su piastre di agar TY integrati con 200 mg / ml di streptomicina e 30 mg / ml di gentamicina, di selezionare per trans integranti. Piatto diluizioni 10 -3 through 10 -7 su piastre di agar TY integrati con 200 mg / ml di streptomicina, per selezionare sia per i trans integranti e dei destinatari potenziali, cioè dei destinatari totali. </li><li> Per l&#39;isolamento di markerless trans integrants risospendere circa un quarto del punto di accoppiamento IMCE in 500 pl di sterile 0,85% NaCl. Effettuare diluizioni seriali di 10 volte a 10 -6. Diluizioni tavola 10 -4 a 10 -6 su quattro piastre di agar TY integrati con 200 mg / ml di streptomicina e 200 mg / ml X-Gluc. </li><li> Incubare le piastre a 30 ° C per 3 giorni. </li><li> Visualizza RFP trans integrants sotto la luce verde (525 nm) e attraverso un filtro rosso (&gt; 610 nm) 15. </li><li> Calcolare l&#39;efficienza IMCE per cento come CFU di trans-integrants CFU rispetto al totale dei destinatari. Circa la metà di trans-integrants sono sottoposti vero scambio cassette che li rende bianchi e spectinomicina sensibile. </li><li> Per trovare i markerless trans integrants (wqui il vettore donatore non contiene Gm r come in pJH110) schermo per una colonia bianco (un periodo di incubazione prolungato, 1-2 giorni supplementari a temperatura ambiente, aumenterà la differenziazione delle colonie tramite X-Gluc, ciò è necessario in S. meliloti SmUW227), confermare la sensibilità del spectinomicina della colonia mediante screening su una piastra di agar TY senza antibiotici e una piastra di agar TY contenente 100 ug / ml spectinomicina. </li></ol> 4. Risultati rappresentativi Dopo tre giorni di incubazione su TY integrato con streptomicina e gentamicina le strisce di controllo non dovrebbe avere alcuna crescita. La striscia IMCE dovrebbe avere crescita confluente sulla striscia testa e molte colonie sulla seconda striscia, come mostrato nella Figura 2. L&#39;efficienza di trans-integrazione, espressa come percentuale di trans-integrants ai destinatari totale, dovrebbe essere nell&#39;intervallo di 0,5%. Circa la metà di trans-integrants sarà spectinomicina sensibili e nerodimostrando di avere subito vero e proprio scambio cassetta. Trans-integrants contenenti il donatore tester rfp cassetta dalla pJH110 dovrebbe visualizzare distinguibile fluorescenza RFP se visto sotto la luce verde (525 nm) e attraverso un filtro rosso (&gt; 610 nm) 15. <img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig1.jpg" alt="Figura 1"/> . Figura 1 illustrazione miscela coniugazione: Con l&#39;aiuto della espressione dei geni di trasferimento di pRK600, tutti i plasmidi sono trasferiti in modo casuale da una cella all&#39;altra. Questo trasferimento comporta la creazione di trans-integrants nella miscela, attraverso l&#39;acquisizione LP-ceppo dei due plasmidi necessari per IMCE, l&#39;integrasi (int) pJC2 plasmide helper e la pJH110 plasmide donatore. La cassetta del donatore non replicante plasmide donatore (pJH110) viene scambiata attraverso ΦC31 integrasi con i marcatori del LP-cassetta sul cromosoma, con conseguente perdita dei marcatori LP (SpR e uidA) e il mantenimento della cassetta donatore (RFP e Gm r) nel risultante trans-integrante. <img src="/files/ftp_upload/3698/3698fig2.jpg" alt="Figura 2"/> Figura 2. A:. Macchia piastra di accoppiamento in modo non selettivo piastra TY mostrando miscele di cellule secche sulla superficie agar B: punti di accoppiamento seminata su streptomicina, gentamicina-X-Gluc piatto, dall&#39;alto a sinistra in senso orario alcun controllo integrasi, IMCE in S. meliloti, E. coli DH5a contenente il controllo pJC2, E. coli DH5a contenente pJH110 controllo, E. coli MT616 controllo e S. . meliloti UW227 di controllo C: 10 -2 diluizione di risospensione accoppiamento punto sul TY streptomicina-X-agar Gluc D:. diluizione 10 -2 di risospensione accoppiamento punto sul TY streptomicina-gentamicina-X-Gluc agar (colonie blu sono ricombinanti singoli, colonie bianche sono stati sottoposti a vere. scambio di cassette) E: 10 -2 diluizione di risospensione punto di accoppiamento sulla streptomicina TY-X-agar Gluc che mostra la mancanza di fluorescenza F:. diluizione 10 -2 di risospensione accoppiamento punto sul TY streptomicina-gentamicina-X-agar Gluc che mostra due livelli di fluorescenza (più brillanti colonie corrispondono a colonie blu e hanno una maggiore espressione rfp presumibilmente a causa di promotore leggere, anche se dalla sequenza vettoriale, dove le colonie che hanno subito true-cassette contengono RFP scambio solo con il suo promotore immediata senza read-through da parte del promotore lac in il vettore, che è assente.).

<ol><li>Itaya, M., Tsuge, K., Koizumi, M., Fujita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+two+genomes+in+one+cell%3A+Stable+cloning+of+the+Synechocystis+PCC6803+genome+in+the+Bacillus+subtilis+168+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Combining two genomes in one cell: Stable cloning of the Synechocystis PCC6803 genome in the Bacillus subtilis 168 genome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 15971-15976 (2005).</li>
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<li>Groth, A. C., Olivares, E. C., Thyagarajan, B., Calos, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phage+integrase+directs+efficient+site-specific+integration+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">A phage integrase directs efficient site-specific integration in human cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 5995-6000 (2000).</li>
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<li>Datsenko, K. A., Wanner, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+inactivation+of+chromosomal+genes+in+Escherichia+coli+K-12+using+PCR+products%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 6640-6645 (2000).</li>
<li>Lesic, B., Rahme, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+lambda+Red+recombinase+system+to+rapidly+generate+mutants+in+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol.%22%5BJournal%5D)">Use of the lambda Red recombinase system to rapidly generate mutants in Pseudomonas aeruginosa.</a> BMC Mol. Biol.. 9, 20-20 (2008).</li>
<li>Choi, K. -H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites%3A+example+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Protocols. 1, 153-161 (2006).</li>
<li>Thomason, L. C., Calendar, R., Ow, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+insertion+and+replacement+in+Schizosaccharomyces+pombe+mediated+by+the+Streptomyces+bacteriophage+FC31+site-specific+recombination+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Genetics+and+Genomics%22%5BJournal%5D)">Gene insertion and replacement in Schizosaccharomyces pombe mediated by the Streptomyces bacteriophage FC31 site-specific recombination system.</a> Molecular Genetics and Genomics. 265, 1031-1038 (2001).</li>
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</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

La tecnica IMCE consente l&#39;integrazione efficace di una singola cassetta DNA attB affiancato nella LP-locus di un ceppo precedentemente progettato. Una volta che il costrutto desiderato viene clonato al posto di RFP per creare la cassetta donatore, la tecnica non richiede successiva purificazione del DNA e trasformazione, che rende molto robusto. È fondamentale che controlli crescita appropriati sono inclusi, per essere certi della resistenza agli antibiotici è dovuta alla creazione di trans-integr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> Streptomicina </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> STP101 </td><td></td></tr><tr><td> Spectinomicina </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> <a href="https://ssl34.alentus.com/bioshopcanada/detail.asp?Pin=SPE201">SPE201</a> </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> GTA202 </td><td></td></tr><tr><td> Choramphenicol </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> CLR201 </td><td></td></tr><tr><td> Tetracycline </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> TET701 </td><td></td></tr><tr><td> Kanamicina </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> KAN201 </td><td></td></tr><tr><td> Batteriologica agar grade </td><td&gt; Bioshop Canada Inc. </td><td> AGR001 </td><td></td></tr><tr><td> Triptone </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> TRP402 </td><td></td></tr><tr><td> Estratto di lievito </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> YEX401 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di sodio </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> SOD001 </td><td></td></tr><tr><td> Cloruro di calcio </td><td> Bioshop Canada Inc. </td><td> CCL444 </td><td></td></tr><tr><td> X-Gluc </td><td> Oro Biotechnology Inc. </td><td> G1281C1 </td><td></td></tr><tr><td> MT616 ceppo E. coli </td><td> Disponibile su richiesta </td><td></td><td> Utilizzato anche al di fuori del nostro laboratorio </td></tr><tr><td> PJC2 ceppo E. coli </td><td> In casa, disponibile su richiesta </td><td></td><td></td></tr><tr><td> PJH110 ceppo E. coli </td><td> In casa, a disposizione dal richt </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SmUW227 ceppo </td><td> In casa, disponibile su richiesta </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

site-specific ingegneria batterica cromosoma: Φc31 integrasi mediated cassette exchange (imce)

Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Il cromosoma batterico può essere utilizzato per mantenere stabilmente il DNA estraneo nel mega-base gamma 1. Integrazione nel cromosoma elude questioni quali la replicazione del plasmide, la stabilità plasmide, incompatibilità plasmide, e il plasmide varianza numero di copie. Questo metodo utilizza il site-specific integrasi dal fago Streptomyces (Φ) C31 2,3. Il ΦC31 integrasi catalizza una ricombinazione diretto tra due specifici siti del DNA: ATTB e attP (34 e 39 bp, rispettivamente) 4. Tale ricombinazione è stabile e non ripristinare 5. Una &quot;pista&quot; (LP) costituito da una sequenza spectinomicina gene di resistenza, aadA (SPR), e la E. coli ß-glucuronidasi gene (uidA) affiancato da siti attP è stato integrato nei cromosomi di Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi e tumefaciens in una regione intergenica, l&#39;ampC locus, e il locus teta, rispettivamente. S. meliloti viene utilizzato in questo protocollo. Vettori contenenti siti donatori mobilizzabile attB fiancheggiano una stuffer rosso proteina fluorescente (RFP) gene e un gene di resistenza agli antibiotici sono stati costruiti. In questo esempio la gentamicina pJH110 resistente plasmide viene utilizzato. Il gene RFP 6 può essere sostituito con un costrutto desiderata con Sph I e Pst I. In alternativa, un costrutto sintetico fiancheggiata da siti attB possono essere subclonato in un vettore mobilizzabile come pK19mob 7. L&#39;espressione del gene ΦC31 integrasi (clonato da pHS62 8) è guidata dal promotore lac, su una vasta gamma mobilizzabile ospite plasmide pRK7813 9. Un protocollo accoppiamento tetraparental viene utilizzato per trasferire la cassetta nel ceppo donatore LP sostituendo i marcatori nella sequenza LP con la cassetta donatore. Queste cellule sono trans-integrants. Trans-integrants sono formate con una efficienza tipica di 0,5%. Trans-integrants trovano tipicamente entro i primi 500-1.000 colonie schermati dalla sensibilità agli antibiotici o blu-nero screening utilizzando 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-glucuronico (X-Gluc). Questo protocollo contiene le procedure di accoppiamento e di selezione per la creazione e isolare trans integranti.

Un metodo rapido ed efficace per integrare DNA estraneo di interesse in pre-fatti ceppi accettori, chiamati ceppi pista di atterraggio, è descritta. Il metodo permette integrazione sito-specifica di una cassetta DNA nel locus ingegnerizzato atterraggio di un dato ceppo, tramite coniugazione e l&#39;espressione del ΦC31 integrasi.

Site-specific Ingegneria batterica Cromosoma: ΦC31 integrasi Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Il cromosoma batterico può essere utilizzato per mantenere stabilmente DNA estraneo nell'ordine dei mega-base1. L'integrazione nel cromosoma evita problematiche quali...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è integrare un costrutto di DNA desiderato nel cromosoma batterico in un locus predeterminato. Questo risultato si ottiene mediante un protocollo di accoppiamento che coinvolge quattro ceppi batterici ingegnerizzati. Il ceppo ricevente possiede una sequenza di atterraggio composta da un gene di resistenza alla specinomicina e dal gene della beta-glucuronidasi di e. coli, delimitati da siti ATP, integrati nel suo cromosoma.Il ceppo donatore P JH one 10 possiede un plasmide contenente siti B che delimitano un gene codificante per una proteina fluorescente rossa, e un gene di resistenza agli antibiotici. Il ceppo donatore PJC due possiede un plasmide contenente l'integrasi sito-specifica del fago streptomiceti C 31 sotto il controllo del promotore LAC. Il quarto ceppo MT 616 fornisce i geni di trasferimento necessari per la coniugazione, il trasferimento di plasmidi da cellula a cellula, che porta alla creazione di trans nei ceppi riceventi.Acquisizione dei due plasmidi necessari per lo scambio di cassette mediato dall'integrasi. Lo scambio della cassetta donatrice dal plasmide PJ H one 10 con i marcatori della cassetta del sito di atterra

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In questo video, dimostriamo l'integrazione del transgene sito-specifico mediata da phiC31 nell'embrione di Anopheles tramite microiniezione. Questo metodo aiuta a introdurre i geni desiderati in un sistema ospite per la ricerca e le applicazioni industriali.

Integrazione transgenica sito-diretta mediata da phiC31-integrasi: una tecnica di microiniezione per l'integrazione di transgeni sito-specifici in un vettore di anofele

Questo protocollo descrive la rilevazione delle integroni di classe 1 e delle cassette geniche ad esse associate negli alimenti.

Screening prodotti alimentari per la Classe 1 integroni e Gene cassette

Qui, presentiamo un protocollo per eliminare un gene di interesse coinvolto nella coniugazione dei plasmidi e successivamente analizzare l'impatto della sua assenza utilizzando saggi di accoppiamento. La funzione del gene viene ulteriormente esplorata in una regione specifica della sua sequenza utilizzando mutazioni di delezione o puntiformi.

Coniugazione saggi di accoppiamento per l&#39;analisi specifica per sequenza di proteine ​​di trasferimento relativi coniugazione batterica

Presentato qui è un metodo semplice per la creazione di una libreria di inserimento ad alta densità trasposone in Escherichia coli o Shigella flexneri mediante coniugazione batterica. Questo protocollo permette la creazione di una collezione di centinaia di migliaia di mutanti unici nei batteri mediante l'inserimento casuale di genomica di un trasposone.

Creazione di una densa trasposone inserimento Biblioteca mediante coniugazione batterica Enterobacterial ceppi come Escherichia Coli e Shigella flexneri

Qui presentiamo un protocollo per l'uso di pre-esistente antibiotico resistenza-cassette eliminazione costrutti come base per la fabbricazione di mutanti di delezione in altri ceppi di Escherichia coli . Tali mutazioni di omissione possono essere mobilitati e inseriti il locus corrispondente di un ceppo destinatario mediante trasduzione del batteriofago P1.

Produzione di delezioni del Gene in Escherichia coli di trasduzione P1 con cassette di resistenza agli antibiotici soggetti ad accisa

Qui, presentiamo un protocollo che descrive come i) assemblare un vettore auto-replicante utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate, ii) introdurre il vettore in un ospite cianobatterico per coniugazione, e iii) caratterizzano ceppi di cianobatteri transgenici utilizzando un lettore di lamele o citometria di flusso.

Modificazione genetica dei cianobatteri mediante congiugazione utilizzando il toolkit di clonazione modulare CyanoGate

Descritto qui è un metodo per la delezione genica mirata e senza marcatori nella chlamydia trachomatis utilizzando la mutagenesi di scambio letale delle cassette scambiate, FLAEM.

Markerless Gene Deletion di Mamicino Scambio Allelicas in Chlamydia trachomatis

L'obiettivo di questo protocollo è fornire una guida dettagliata e dettagliata per assemblare costrutti multi-genico utilizzando il sistema di clonazione modulare basato sulla clonazione di Golden Gate. Fornisce anche raccomandazioni sui passaggi critici per garantire un assemblaggio ottimale in base alle nostre esperienze.

Assemblaggio rapido di costrutti multi-gene utilizzando la clonazione modulare del Golden Gate

Il protocollo descrive come ottenere modifiche dirette al sito nel genoma delle zanzare Anopheles malaria utilizzando il sistema φC31 . Le modifiche descritte includono sia l'integrazione che lo scambio di cassette transgeniche nel genoma di linee di attP..

Integrazione mediata dal sito φC31 e scambio di cassette in Anopheles Vettori della malaria

Abbiamo sviluppato una matrice extracellulare del polmone decellularized e bioreattore romanzo biomimetici che può essere utilizzato per generare il tessuto funzionale del polmone. Con la semina delle cellule e nella matrice coltura nel bioreattore, generiamo tessuto che dimostra efficace scambio di gas quando trapiantate in vivo per brevi periodi di tempo.

Procedura per l&#39;Ingegneria del polmone

Impara l'integrazione sito-specifica del DNA nei cromosomi batterici utilizzando la tecnica IMCE con ΦC31 integrasi e coniugazione. Questo metodo efficiente consente modifiche genetiche precise in diversi ceppi microbici.

Site-specific Ingegneria batterica Cromosoma: ΦC31 integrasi Mediated Cassette Exchange (IMCE)

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