Site-specific Ingegneria batterica Cromosoma: ΦC31 integrasi Mediated Cassette Exchange (IMCE)

L'obiettivo generale del seguente esperimento è integrare un costrutto di DNA desiderato nel cromosoma batterico in un locus predeterminato. Questo risultato si ottiene mediante un protocollo di accoppiamento che coinvolge quattro ceppi batterici ingegnerizzati. Il ceppo ricevente possiede una sequenza di atterraggio costituita da un gene di resistenza alla specinomicina e dal gene della beta-glucuronidasi di e coli, delimitati da siti ATP, integrati nel suo cromosoma.

Il ceppo donatore PJH-one-10 possiede un plasmide contenente siti B che delimitano un gene codificante per una proteina fluorescente rossa di riempimento, nonché un gene di resistenza agli antibiotici. Il ceppo donatore PJC-two possiede un plasmide contenente l'integrasi sito-specifica del fago Streptomyces C31 sotto il controllo del promotore LAC. Il quarto ceppo, MT616, fornisce i geni di trasferimento necessari per la coniugazione, il trasferimento di plasmidi da cellula a cellula, che porta alla creazione di trans nei ceppi riceventi.

Acquisizione dei due plasmidi necessari per lo scambio di cassetta mediato dall'integrasi. Lo scambio della cassetta donatrice dal plasmide PJ H one 10 con i marcatori della cassetta di atterraggio sul cromosoma determina la perdita dei marcatori della cassetta di atterraggio, SPR e UIDA, e il mantenimento della cassetta donatrice RFP e GMR nel transimmigrato risultante. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi, come la ricombinazione omologa, è la semplicità e l'efficienza del protocollo.

È inoltre trasferibile a un'ampia gamma di batteri. Il ceppo accettore utilizzato in questo video è un ceppo di S. milli coltivato due giorni prima della procedura di accoppiamento per la creazione di transintegrine: inoculare, a partire da una singola colonia, in cinque millilitri di terreno TY con spectinomicina; incubare il ceppo di S. milli a 30 gradi Celsius per due giorni con agitazione, il giorno precedente la procedura di accoppiamento inoculare ciascuno dei seguenti ceppi di E. coli in cinque millilitri di terreno liquido LB integrato con l'antibiotico appropriato: DH5α contenente il plasmide di espressione dell'integrasi nel terreno con tetraciclina, MT616, il mobilizzatore intermedio con cloramfenicolo e DH5α contenente il plasmide del cassetto donatore nel terreno con gentamicina; incubare i tre ceppi di E. coli tutta la notte a 37 gradi Celsius con agitazione costante per preparare le cellule alla procedura di accoppiamento. Trasferire 1,5 millilitri di ciascuna delle quattro colture in una provetta e centrifugare a 17.000 × g per 30 secondi per raccogliere il pellet cellulare, eliminare il terreno e risospendere ciascun pellet cellulare in un millilitro di cloruro di sodio sterile allo 0,85%; centrifugare nuovamente le provette dopo aver eliminato il surnatante; risospendere ciascun pellet in 100 microlitri di cloruro di sodio sterile allo 0,85% utilizzando una pipetta; depositare singolarmente 10 microlitri di coltura lavata per ciascun ceppo su una piastra di agar TY semplice.

Questi punti sono punti di controllo. Successivamente, aggiungere 40 microlitri di ciascun ceppo, escludendo l'e coli DH cinque alfa contenente Pjc due, in un tubo sterile e mescolare aspirando e dispensando con la pipetta. Applicare 120 microlitri di questa miscela sulla piastra di agar TY semplice. Questo punto è il controllo negativo senza integrasi.

Infine, aggiungere 40 microlitri di ciascuno dei quattro ceppi in una provetta sterile, mescolare e depositare 160 microlitri di questa miscela sulla stessa piastra di agar TDY. Questa è la zona di accoppiamento per lo scambio di cassetta mediato da integrasi.

Posizionare la piastra in una cappa a flusso laminare e lasciare asciugare le colonie per circa 20 minuti. Sigillare la piastra e incubare a 30 gradi Celsius durante la notte, il giorno successivo al tracciamento secondo il protocollo di accoppiamento. Le due colonie di controllo e la colonia di accoppiamento IMCE su piastre di agar TY supplementate con streptomicina e gentamicina.

Il ceppo accettore S milli presenta una mutazione che conferisce resistenza ad alto livello alla streptomicina, necessaria per il calcolo dell'efficienza IMCE. Ri-sospendere circa un quarto del punto di coniugazione IMCE in 500 microlitri di cloruro di sodio sterile allo 0,85%. Eseguire diluizioni seriali decrescenti fino a 10 alla meno sette. Piastrare le diluizioni dalla 10 alla meno due alla 10 alla meno cinque su piastre di agar TY addizionate con streptomicina, gentamicina e xgl per selezionare i trasconjuganti. Piastrare le diluizioni dalla 10 alla meno tre alla 10 alla meno sette su piastre di agar TY addizionate con streptomicina e xgl per selezionare sia i trasconjuganti che i potenziali ceppi recettori. Incubare le piastre, contenenti il numero totale di recettori, a 30 gradi Celsius per tre giorni.

Visualizzare la trasformazione RFP sotto luce verde e attraverso un filtro rosso; calcolare la percentuale di efficienza IMCE come CFU dei trasformanti immigrati rispetto alle CFU dei ricettori totali. Dopo tre giorni di incubazione su Ty integrato con streptomicina e gentamicina, circa la metà dei trasformanti avrà subito uno scambio reale, diventando bianchi e insensibili. Non dovrebbe verificarsi alcuna crescita nei seguenti ceppi di controllo: controllo senza integrasi, s. millilatte UW 2 27, controllo e. coli MT 616, controllo e. coli DH5α contenente P JH110, e controllo e. coli DH5α contenente PJC2. Al contrario, l'IMCE prelevato dal punto di coniugazione dovrebbe mostrare crescita confluenza nella prima linea di striatura e numerose colonie nella seconda striatura. Le prossime due immagini mostrano sospensioni risosse di un’aliquota diluita 10 alla meno due del punto di coniugazione su agar TY con streptomicina e xgl, e su agar TY con streptomicina, gentamicina e xgl.

Le colonie blu sono ricombinanti singoli. Mentre le colonie bianche sono integrine trans che hanno subito un vero scambio di cassetta quando osservate alla luce verde e attraverso un filtro rosso, queste tendono a non mostrare fluorescenza nel saggio di accoppiamento diluito di due ordini di grandezza della sospensione resus su agar TY strept cin xgl. Al contrario, la diluizione 10 alla meno due della sospensione resus del punto di accoppiamento su agar Ty streptomicina Gentamicina Xgl mostra due livelli di fluorescenza.

Le colonie più luminose corrispondono a colonie blu e presentano un'espressione più elevata di RFP, presumibilmente a causa di una lettura attraverso il promotore LAC presente nel vettore. Le colonie meno luminose corrispondono a colonie bianche, che hanno subito uno scambio reale della cassetta e contengono RFP con il solo promotore immediato, senza lettura attraverso il promotore LAC. Queste colonie dovrebbero inoltre essere sensibili alla spectinomicina.

L'efficienza dell'integrazione in trans, espressa come percentuale di batteri ricombinanti in trans rispetto al numero totale di riceventi, dovrebbe essere nell'intervallo dello 0,5%. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare la coniugazione batterica, impiegando i nostri ceppi ingegnerizzati, per inserire costrutti di DNA nel cromosoma batterico.