Proteina fluorescente verde sistema di visualizzare gli effettori consegnati dai batteri durante l'infezione Split

Approcci basati sulla proteina fluorescenti per monitorare gli effettori secernuti dai batteri nelle cellule ospiti sono impegnativi. Ciò è dovuto all'incompatibilità tra proteine fluorescenti e il sistema di secrezione di tipo III. Qui, un sistema GFP superfolder ottimizzato split viene utilizzato per la visualizzazione degli effettori secernuta dai batteri nella cellula della pianta ospite.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'interazione pianta-microbi, come ad esempio il modo in cui i batteri patogeni possono disturbare le condizioni ottimali delle loro cellule vegetali ospiti utilizzando proteine chiamate effettori secrete nelle cellule vegetali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la proteina effettrice batterica viene espressa nella cellula batterica utilizzando il loro sistema di espressione nativo e quindi consegnata alla cellula vegetale attraverso il sistema di secrezione batterica di tipo III. Per iniziare questa procedura, preparare le piante di Nicotiana benthamiana e Arabidopsis thaliana come indicato nel protocollo di testo.

Successivamente, utilizzare l'elettroporazione standard per trasformare il gene portatore del plasmide e l'effettore fusi al tag sfGFP11 nel ceppo CUCPB5500 di pomodoro patovare Pseudomonas syringae. Il punto temporale ottimale e il livello di espressione, o sfGFP ricostituibile, dipendono in realtà dalla proteina effettrice. Si consiglia di ottimizzare le condizioni di inoculazione o di osservazione.

Distribuire delicatamente le cellule batteriche trasformate sulla superficie delle piastre King's B Agar. Quindi incubare le piastre a 28 gradi Celsius per due giorni. Successivamente, inoculare una colonia batterica nel terreno liquido King's B con un antibiotico appropriato per il vettore.

Incubare per una notte a 28 gradi Celsius con agitazione a 200 giri/min. Il giorno successivo, aggiungere glicerolo autoclavato al terreno inoculato fino a una concentrazione finale del 50%Conservare a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Per iniziare, trasformare il plasmide in cellule del ceppo GV3101 dell'Agrobacterium tumefaciens come indicato nel protocollo di testo.

Far crescere le cellule su terreno LB Agar integrato a 28 gradi Celsius per due giorni. Utilizzando una singola colonia del terreno LB Agar, inoculare 5 millilitri di terreno LB liquido integrato. Quindi, far crescere le cellule durante la notte a 28 gradi Celsius con agitazione a 200 giri/min.

Successivamente, centrifugare a 3000 G per 10 minuti per raccogliere le cellule. Versare il surnatante e rimettere in sospensione il pellet in 1 millilitro di tampone di infiltrazione appena fatto. Utilizzando uno spettrofotometro, determinare la quantità di cellule di Agrobacterium misurando il valore della densità ottica a un'assorbanza di 600 nanometri.

Quindi, utilizzare il tampone di infiltrazione per regolare l'OD 600 delle cellule batteriche a 0,5. Lasciare la coltura su un dondolo delicato a temperatura ambiente per una o cinque ore. Per infiltrarsi nelle foglie, utilizzare la punta della pipetta da 10 microlitri per praticare un foro al centro di ogni foglia.

Utilizzare una siringa da 1 millilitro senza ago per iniettare con cura 500 microlitri della sospensione di Agrobacterium nel lato adassiale della foglia. Pulisci la sospensione batterica rimanente dalle foglie e segna il confine della regione infiltrata. Conserva le piante infiltrate in una camera di crescita a 25 gradi Celsius e 60% di umidità per due giorni.

Strisciare il ceppo di Pseudomonas trasformato dal ceppo di glicerolo sul terreno King's B Agar con l'antibiotico appropriato. Incubare a 28 gradi Celsius per due giorni. Inoculare un anello di cellule di Pseudomonas in un terreno liquido di mannitolo glutammato.

Incubare la coltura per una notte a 28 gradi Celsius con agitazione a 200 giri/min. Successivamente, centrifugare a 3000 G per 10 minuti per raccogliere le cellule. Versare il surnatante e risospendere il pellet in una soluzione di cloruro di magnesio da 10 millimolari.

Quindi, regolare la densità ottica a 0,02 per le foglie di Nicotiana benthamiana e a 0,002 per le foglie di Arabidopsis. Per le foglie di Nicotiana benthamiana, infiltrare la sospensione di Pseudomonas nella stessa area in cui l'Agrobacterium è stato infiltrato due giorni prima. Per l'Arabidopsis transgenico, infiltrare la sospensione di Pseudomonas in due foglie di quattro settimane coltivate a breve distanza di giorno.

Infine, ritaglia un disco fogliare per le foglie inoculate con Pseudomonas. In momenti specifici dopo l'infiltrazione di Pseudomonas, utilizzare un sistema di scansione laser confocale per visualizzare due dischi fogliari di due centimetri quadrati dalla singola pianta. Osservare le celle lontane dal foro di infiltrazione per evitare che le cellule morte vengano uccise dalle ferite.

Gli effettori traslocati dai batteri sono presenti solo in quantità molto piccole. Pertanto, è possibile aumentare la potenza del laser e ottenere un'emissione di fluorescenza per rilevare un segnale fluorescente. Tuttavia, non esagerare per evitare di catturare falsi segnali dall'autofluorescenza dalle cellule vegetali.

In questo studio, viene utilizzato un approccio basato su proteine fluorescenti per monitorare gli effettori secreti dai batteri nelle cellule ospiti. Qui viene mostrata una scansione laser confocale di una foglia di Nicotiana benthamiana tre ore dopo l'infezione. Le cellule che esprimono sfGFP ottimizzata con solo AvrB non mostrano alcun segnale fluorescente.

Tuttavia, i segnali GFP sono osservati dalle cellule infette contenenti AvrB, sfGFP11. Questo verifica che il complesso sfGFP11 di AvrB sia ricostituito con sfGFP ottimizzato nel citosol e quindi trasloca sulla membrana plasmatica. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere sani i materiali vegetali e di preparare una coltura batterica fresca per le cellule attive.

Seguendo questa procedura, possono essere preparati altri metodi come l'analisi del sangue in resina per comprendere la falsa modifica della traduzione delle proteine effettrici dei batteri nelle cellule vegetali durante le risposte immunitarie delle piante. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come visualizzare la consegna dell'effettore di tipo III nelle cellule vegetali infette. I materiali vegetali e le colture batteriche devono essere smaltiti seguendo i criteri del laboratorio per i rifiuti a rischio biologico e non dimenticare di indossare i DPI.