Name: Proteina fluorescente verde sistema di visualizzare gli effettori consegnati dai batteri durante linfezione Split (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Scopri come visualizzare gli effettori batterici nelle cellule vegetali utilizzando il sistema split superfolder GFP ottimizzato con Nicotiana benthamiana e Arabidopsis thaliana. Questo metodo avanza la ricerca sulle interazioni pianta-patogeno.

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Questa ricerca è stata sostenuta dal programma di base scienza ricerca attraverso la nazionale Ricerca Fondazione della Corea (NRF) finanziato dal Ministero della scienza, ICT e pianificazione futura (NRF-2018R1A2A1A05019892) a DC e da una sovvenzione dal centro di allevamento vegetale molecolare ( PMBC) del programma di prossima generazione Biogreen 21 dell'amministrazione di sviluppo rurale (PJ013201) EP. Si ringrazia il centro di imaging del centro nazionale di strumentazione per la gestione ambientale fornire un microscopio confocale per le riprese.

Nota: Tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente, se non diversamente specificato.
1. preparazione dei materiali vegetali (4 settimane)
<ol><li>Preparazione per le piante di benthamiana N.<ol>
<li>Seminare i 2 semi di N. benthamiana sulla superficie del suolo di ogni piatto, coprire il vassoio con una cupola di plastica e consentire semi di germinare in a 25 ° C, 60% camera di crescita di umidità con un ciclo di 16/8-h chiaro/scuro fotoperiodo.</li>
		<li>Dopo due settimane, è possibile scegliere e scartare il più piccolo semenzale in ogni pentola e continuare a coltivare le piante sotto le stesse condizioni di crescita applicati per la germinazione nel passaggio 1.1.1. Aggiungere 1 L di acqua al vassoio ogni due giorni. Nota: Le condizioni di crescita per piante possono variare attraverso laboratori. Pertanto, seguire il protocollo di irrigazione regolare per far crescere la pianta in buone condizioni di salute.</li>
		<li>In una settimana, trasferire le piante a un nuovo vassoio e disporle con uno spazio adeguato per un'ulteriore crescita. Continuano a crescere le piante nelle condizioni descritte al punto 1.1.1, finché non sono pronti per essere infiltrato a 4 settimane di età. Nota: La crescita delle piante può differire a seconda delle condizioni di crescita attraverso laboratori. Di solito, troviamo che il 4-settimana-vecchio N. benthamiana piante sopportano circa sei foglie.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparazione di piante transgeniche di a. thaliana<ol>
<li>Fare riferimento alla Tabella materiali e ordinare le sementi transgeniche di Arabidopsis .</li>
		<li>Immergere le sementi transgeniche di Arabidopsis ~ 50-100 in 1 mL di acqua distillata e conservarli a 4 ° C per 3 giorni al buio per sincronizzare l'inizio della germinazione.</li>
		<li>Seminare i semi di ~ 2-3 sulla superficie del suolo di un vassoio di pianta di spina e coprire il vassoio con una cupola di plastica. Consentire semi di germinare a 23 ° C, umidità 60% con un ciclo di 10/14-h chiaro/scuro fotoperiodo. Nota: I semi dovrebbero essere omozigoti. Tuttavia, si consiglia di riconfermare la presenza del transgene nel batch. In questo caso, sterilizzare i semi mediante lavaggio con etanolo al 70% per 2 min, 50% candeggina (ipoclorito di 2% circa) contenente 0,05% triton X-100 per 5 min seguite da 5 - 6 volte di lavaggio con acqua distillata doppia sterile (ddH2O). Dopo la sterilizzazione stratifica a 4 ° C per 3 giorni e impiattatelo su supporti di germinazione di piante contenenti 25 µ g/L di igromicina B per selezionare le piante transgeniche.</li>
		<li>Dopo una settimana, lasciare solo una pianta per spina e continuare a crescere piante sotto le stesse condizioni di crescita utilizzate per passo 1.2.3. Nota: I quattro-settimana-vecchi piante erano usate per l'infezione di p. syringae . Acqua piante ogni giorno per mantenere le piante sane.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. preparazione della cultura Pseudomonas (~ 1 settimana)
<ol><li>Costruzione del plasmide per trasformazione di Pseudomonas<ol>
<li>Fare riferimento alla Tabella materiali e ordinare il tutt' desiderata dell'effettore basati su T3SS consegna sistema vettoriale25.</li>
		<li>Inserire il gene dell'effettore di interesse il vettore di consegna effettrici tramite clonazione25site-specific di ricombinazione. Nota: Durante il monitoraggio di localizzazione subcellulare delle proteine effettrici full-length, mettere il gene full-length in pBK-GW-1-2 o pBG-GW-1-2. È anche possibile scegliere pBK-GW-1-4 o pBG-GW-1-4 che contiene 2 x sfGFP11 per aumentato il segnale di fluorescenza. Nel caso di un effettore parziale carente peptide segnale, utilizzare pBK-GW-2-2 o pBK-GW-2-4. Fare riferimento a Park et al. per informazioni dettagliate su effettrici consegna vettori25.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trasformare il plasmide che trasportano un effettore fuso per il tag sfGFP11 a p. syringae pv. Pomodoro (Pst) CUCPB5500 usando elettroporazione standard29. Nota: Altri ceppi di Pseudomonas possono essere utilizzati se necessario. Il sistema di tag sfGFP11 è costruito per una vasta gamma di vettori30 e l'espressione genica dell'effettore è regolato dal promotore AvrRpm1, che è paragonabile con, per esempio, Pseudomonas fluorescens (EthAn)31.</li>
	<li>Diffondere le cellule batteriche trasformate delicatamente sopra la superficie delle piastre di agar del re B contenente 100 µ g/mL rifampicina e kanamicina di 25 µ g/mL o 25 µ g/mL Gentamicina. Incubare a 28 ° C per 2 giorni.</li>
	<li>Inoculare una colonia in mezzi liquidi di B del re con antibiotici appropriati per il vettore utilizzato e far crescere le cellule durante la notte a 28 ° C con agitazione a 200 giri/min.</li>
	<li>Fare un magazzino di glicerolo. Aggiungere glicerolo in autoclave ad una concentrazione finale di 50% e conservare a-80 ° C.</li>
</ol>3. transitoria espressione di targeting organello sfGFP1-10OPT in N. benthamiana (4 giorni)
<ol><li>Preparazione della cultura dell'agrobatterio<ol>
<li>Ordine il desiderato tutt' di targeting organello sfGFP1-10OPT plasmid(s) (fare riferimento alla Tabella materiali).</li>
		<li>Trasformare il plasmid(s) in Agrobacterium tumefaciens ceppo GV3101 cellule32. Crescere le cellule su agar di Luria-Bertani (LB), completati con kanamicina di 50 µ g/mL e 50 µ g/mL rifampicina a 28 ° C per 2 giorni.</li>
		<li>Da una singola colonia sull'agar LB, inoculare le cellule in 5 mL di terreno liquido LB completati con 50 µ g/mL kanamicina e rifampicina di 50 µ g/mL. Crescere le cellule durante la notte a 28 ° C con agitazione a 200 giri/min.</li>
		<li>Raccolto le cellule mediante centrifugazione a 3.000 x g per 10 min versare fuori i media surnatante e risospendere il pellet in 1 mL di appena fatto buffer di infiltrazione.</li>
		<li>Misura della quantità di Agrobacterium ottenendo il valore di densità ottica (OD) presso un'assorbanza di 600 nm (Abs 600 nm). Regolare il OD600 dei batteri a 0,5 con buffer di infiltrazione. Nota: 1 mL di sospensione è sufficiente per infiltrarsi su due punti.</li>
		<li>Lasciare la cultura a temperatura ambiente su un delicato rocker per 1-5 h prima infiltrazione.</li>
		<li>Fare un buco al centro delle foglie per essere infiltrato con una punta di 10 µ l. Utilizzare una siringa senza ago da 1 mL per infiltrare le sospensioni di Agrobacterium . Lentamente e con cautela iniettare circa 500 µ l delle sospensioni preparate dal punto 3.1.5 nel lato adassiale foglia tramite la siringa. Ripetere l'infiltrazione su almeno tre piante diverse per repliche sperimentali. Nota: Per motivi di salute e sicurezza, protezione degli occhi deve essere indossato durante l'infiltrazione.</li>
		<li>Pulire il restante sospensione batterica sulle foglie e segnano il confine della regione infiltrata.</li>
		<li>Mantenere le piante infiltrate sotto le stesse condizioni di crescita usate per passaggio 1.1.1 per 2 giorni.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. inoculazione di Pseudomonas (4 giorni)
<ol><li>Striscia il ceppo di Pseudomonas trasformato dallo stock di glicerolo nel passo 2.5 su supporti di agar B del re con gli antibiotici adatti a 28 ° C per 2 giorni. Nota: La salute di Pseudomonas è molto critica. Se colonie non fanno bene, striscia ancora una volta le cellule o propagare le cellule in liquidi del re prima di procedere.</li>
	<li>Inoculare un loopful delle cellule di Pseudomonas in mezzi liquidi di mannitolo-glutammato (MG) a 28 ° C con agitazione a 200 giri/min per una notte.</li>
	<li>Raccolto le cellule mediante centrifugazione a 3.000 x g per 10 min versare fuori media surnatante, risospendere il pellet in 10mm MgCl2e regolare il OD600 a 0.02 (1 x 107 cfu/mL) per N. benthamiana foglie e a 0,002 (1 x 106 CFU/mL) per Arabidopsis lascia.
</li>
	<li>Per il N. benthamiana, infiltrarsi la sospensione di Pseudomonas nell'area delle foglie dove l' agrobatterio che trasportano sfGFP1-10OPT costrutto si è infiltrato in 2 giorni in precedenza (come al punto 3.1.7). Per il sfGFP1-10OPT transgenici Arabidopsis, infiltrarsi la sospensione di Pseudomonas due 4-settimana-vecchio breve giorno-grown foglie. Nota: almeno tre impianti sono necessari per repliche sperimentali.</li>
</ol>5. osservazione di sfGFP segnale tramite microscopia confocale (1 giorno)
<ol><li>Tagliare il disco di foglia da Pseudomonas-inoculato foglie. A intervalli di tempo specifici dopo l'infiltrazione di Pseudomonas, immagine due dischi di 2 cm2 foglia dalla pianta singola utilizzando un laser a scansione confocale sistema con 40 X / 1.2 obiettivo a immersione in acqua NA C-Apochromat o 63 X / 0,8 NA C-Apochromat olio da immersione obiettivo. Per evitare le cellule morte, uccidere dal ferimento, osservare le cellule via dal foro di infiltrazione.</li>
	<li>Iniziare l'osservazione con un'impostazione di bassa potenza del laser di argon a 488 nm. Aumentare la potenza del laser per rilevare sfGFP. Nota: Usiamo solitamente 2-15% dell'intensità del laser per rilevare il segnale di fluorescenza. Tuttavia, la potenza del laser e l'impostazione di rilevamento deve essere regolate basata su sistema di microscopia dell'utente. Qui, i filtri di emissione sono stati impostati a 520-550 nm. Le cellule morte emettono spesso auto-fluorescenza sotto l'eccitazione laser 488 nm. Pertanto, come controllo negativo, l'effettore stesso senza il cartellino del sfGFP11 dovrebbe essere infiltrato e osservato nelle stesse condizioni di osservazione. Inoltre, eccitazione laser alta può indurre clorofilla autofluorescenza. Di conseguenza, regolare l'intensità del laser utilizzando cellule della pianta di controllo per non indurre clorofilla autofluorescenza.<ol>
<li>Per una colorazione di contrasto della parete delle cellule, infiltrarsi ioduro di propidio 20mm (PI) il disco di foglia a 5-10 min prima osservazione.</li>
		<li>Per il nucleo di macchiatura, immergere i dischi di foglia in 0,1% paraformaldeide per 5 min seguita da lavaggio con acqua. Quindi, si infiltrano il 10 mM PI nel disco foglia a 5-10 min prima osservazione microscopica. Ripetere gli esperimenti almeno tre volte. Nota: Questo passaggio non è critica ma utili per definire la localizzazione dell'effettore alla membrana plasmatica o il nucleo. Se gli effettori di interesse hanno mostrato la loro localizzazione in un organello specifico, è possibile utilizzare un indicatore per l'organello dato per confermare la localizzazione dell'effettore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Boyes, D. C., Nam, J., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana+RPM1+disease+resistance+gene+product+is+a+peripheral+plasma+membrane+protein+that+is+degraded+coincident+with+the+hypersensitive+response%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).</li>
<li>Nimchuk, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eukaryotic+fatty+acylation+drives+plasma+membrane+targeting+and+enhances+function+of+several+type+III+effector+proteins+from+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae.</a> Cell. 101 (4), 353-363 (2000).</li>
<li>Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+intracellular+innate+immune+receptor+Resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+maculicola+1+%28RPM1%29+is+activated+at%2C+and+functions+on%2C+the+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).</li>
<li>Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+scalable+strategy+for+high-throughput+GFP+tagging+of+endogenous+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse a divulgare.

Il protocollo descritto qui è utilizzato per il monitoraggio la localizzazione esatta delle proteine effettrici iniettato dal T3SS batterica nella cellula ospite pianta al momento dell'infezione. In precedenza, il sistema GFP Spalato è stato utilizzato come strumento per studiare la localizzazione subcellulare delle proteine di mammifero23,36, Salmonella T3E localizzazione e Agrobacterium VirE2 consegna attraverso il T4SS nella impianto di cellu...

Le piante sono organismi sessili che incontrano numerosi agenti patogeni d'invasione, inclusi batteri, funghi, virus, insetti e nematodi durante il loro ciclo di vita. Tra i fitopatogeni, i batteri patogeni Gram-negativi come Pseudomonas spp e Ralstonia spp., infettare le loro piante ospiti inserendo attraverso ferite o aperture naturali, come gli stomi e Idatodi1. Per colonizzare con successo piante ospiti, batteri patogeni si sono evolute per sviluppare una varietà di fattori di virulenza2. Quando i batteri invadono una pianta ospite, iniettano una serie di proteine di virulenza — conosciuto come effettori — direttamente nelle cellule della pianta per promuovere la loro patogenicità. Questi effettori sopprimono o modulano l'immunità innata di pianta e manipolare i processi cellulari di host per provocare la sopravvivenza batterica3.
Batteri patogeni usano principalmente un T3SS per fornire proteine effettrici direttamente in host cellule4. Il T3SS assomiglia ad una siringa molecolare con un canale di aghiformi collegare da una struttura di proteine impalcatura attraverso l'interno e le membrane batteriche esterne al sito di iniezione della cellula ospitante5. Questo meccanismo di secrezione T3SS-mediata dell'effettore (T3E) è ben conservato in vari batteri patogeni Gram-negativi della pianta così come umana. Uno degli agenti patogeni fitosanitario rappresentativo, il p. syringae pv. Pomodoro Dc3000 CRHC mutante che ha tipicamente un T3SS difettoso, ha limitato la crescita nelle piante probabilmente dovuto l'incapacità di questo mutante per sopprimere completamente la pianta immunità (iniettando proteine effettrici)6. Al momento di traslocazione in cellule dell'ospite, effettori bersaglio varie proteine ospite che sono importanti per il sistema host delle cellule, compreso le risposte di difesa della pianta, trascrizione genica, morte cellulare, proteasoma, traffico delle vescicole e ormone vie7 , 8 , 9 , 10. Pertanto, rilevamento della localizzazione cellulare delle proteine effettrici in cellule dell'ospite è un obiettivo attraente per capire le loro funzioni rispetto alla modulazione dell'immunità pianta.
La maggior parte degli studi di localizzazione della T3Es hanno impiegato la sovraespressione dell'agrobatterio -mediata con una proteina di grande fluorescenza nella pianta ospite9. Tuttavia, il metodo di espressione eterologa di geni che vengono introdotti in altre specie ha dimostrato di essere mis-localizzata o occasionalmente non-funzionali11,12,13. Inoltre, diversi studi hanno rivelato che gli effettori batterici subiscano modifiche per il targeting corretto nel host cellule14,15,16,17. Di conseguenza, espresso transitoriamente effettori nel citosol della pianta cellule non possono essere funzionalmente o quantitativamente identiche agli effettori che sono trasportati da T3SS all'agente patogeno infezione18. Inoltre, la fusione di grandi tag fluorescente da proteine effettrici potrebbe interferire con il corretto effettrici consegna e visualizzazione18,19. Pertanto, questi approcci di saggiare la funzione T3E potrebbero non corrispondere completamente la localizzazione nativa degli effettori T3SS-secreto.
Una proteina fluorescente verde (GFP) è composto da un filamento 11 β-barilotto che racchiude un filo centrale che include un cromoforo20. Waldo et al. segnalato un sistema di romanzo Spalato-GFP che consiste di un piccolo componente (GFP β filo 11; GFP11) e un grande frammento complementare (strand β di GFP 1-10; GFP1-10)21. I frammenti non reagiscono da soli ma reagiscono in su loro autoassociazione quando entrambi i frammenti sono in stretta vicinanza con l'altro. Per l'ottimizzazione dell'efficienza della proteina pieghevole, pieghevole robusti varianti della GFP, vale a dire, sfGFP e sfGFPOPT, sono state successivamente sviluppate per21,20,del sistema GFP Spalato,22. Recentemente, il singolo amminoacido mutato varianti di sfGFP1-10OPT- sfYFP1-10OPT e sfCFP1-10OPT- che può ricostituire con un frammento di sfGFP11 e fluorescenza giallo e ciano Visualizza rispettivamente, sono stati generati23 . Inoltre, sfCherry, un derivato di mCherry, può essere suddiviso in frammenti sfCherry1-10 e sfCherry11 nello stesso modo come sfGFP23.
Questo sistema è stato adattato per etichettare e traccia gli effettori T3SS in cellule HeLa durante infezione usando gli effettori da Salmonella24. Tuttavia, è stato tradotto non ottimizzato per il sistema di impianto-batterico patogeno di host. Recentemente, abbiamo ottimizzato il sistema GFP Spalato basato sul migliore sfGFP1-10OPT per monitorare la localizzazione subcellulare di T3Es consegnato da p. syringae in pianta cellule25. Per facilitare gli studi di localizzazione di T3Es a diversi compartimenti subcellulari nelle cellule della pianta, un insieme di transgeniche di Arabidopsis thaliana piante sono stati generati per esprimere sfGFP1-10OPT in vari compartimenti subcellulari 25. Inoltre, i plasmidi che trasportano una varietà di organello targeting sfGFP1-10OPT per l' agrobatterio-mediata sovraespressione transitoria e i vettori di sfGFP11-etichetta per la consegna di basati su T3SS effettrici inoltre sono stati generati. I semi di varie linee transgeniche di Arabidopsis e i plasmidi per esprimere la T3Es di interesse possono essere ottenuti da fonti menzionate nel Tabella materiali26,27.
Nel seguente protocollo, descriviamo un sistema ottimizzato per monitorare le dinamiche degli effettori consegnati da batteri nelle cellule ospiti utilizzando il sistema di sfGFP di Spalato. Infezione di piante esprimenti sfGFP1-10OPT con transgenici Pseudomonas che trasportano il plasmide ricombinante sfGFP11 provoca una consegna dell'effettore sfGFP11-contrassegnati da Pseudomonas nella cellula ospite. Di conseguenza, queste proteine vengono ricostituite e traslocano nei comparti di destinazione effettrici specifiche. La Pseudomonas syringae pv. pomodoro Ceppo di CUCPB5500 in cui vengono eliminati gli 18 effettori, è stato utilizzato perché questo ceppo ha mostrato bassa o nessuna morte delle cellule in sia a. thaliana e N. benthamianas28. Tuttavia, tutti i materiali e i passaggi descritti qui può essere sostituiti o modificati per adattare il sistema di sfGFP di Spalato per indagine di altre domande biologiche o di ottimizzazione in condizioni di laboratorio dato.

<table><tbody><tr><td>Arabidopsis linee transgeniche</td><td></td><td></td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, SP Monitoraggio spaziotemporale degli effettori di Pseudomonas syringae tramite secrezione di tipo III utilizzando frammenti proteici fluorescenti divisi. Cellula vegetale. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td></tr><tr><td>CYTO-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69831</td><td></td></tr><tr><td>NU-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69832</td><td></td></tr><tr><td>PT-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69833</td><td></td></tr><tr><td>MT-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69834</td><td></td></tr><tr><td>PX-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69835</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69836</td><td></td></tr><tr><td>GO-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69837</td><td></td></tr><tr><td>PM-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69838</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide sfGFP1-10OPT mirato agli organelli</td><td></td><td></td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, SP Monitoraggio spaziotemporale degli effettori di Pseudomonas syringae tramite secrezione di tipo III utilizzando frammenti proteici fluorescenti divisi. Cellula vegetale. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td></tr><tr><td>CYTO-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97387</td><td></td></tr><tr><td>NU-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97388</td><td></td></tr><tr><td>PT-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97389</td><td></td></tr><tr><td>MT-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97390</td><td></td></tr><tr><td>PX-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97391</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97392</td><td></td></tr><tr><td>GO-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97393</td><td></td></tr><tr><td>PM-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97394</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfCherry1-10</td><td>Addgene</td><td>97403</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfYFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97404</td><td></td></tr><tr><td>CYTO-sfCFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97405</td><td></td></tr><tr><td>sfGFP11-taged Vettore compatibile con gateway per il sistema di rilascio dell'effettore basato su T3SS</td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. & Dinesh-Kumar, SP Monitoraggio spaziotemporale degli effettori di Pseudomonas syringae tramite secrezione di tipo III utilizzando frammenti proteici fluorescenti divisi. Cellula vegetale. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pBK-GW-1-2</td><td>Addgene</td><td>98250</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla kanamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-1-4</td><td>Addgene</td><td>98251</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla kanamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-2-2</td><td>Addgene</td><td>98252</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla kanamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-2-4</td><td>Addgene</td><td>98253</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla kanamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-1-2</td><td>Addgene</td><td>98254</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla gentamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-1-4</td><td>Addgene</td><td>98255</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla gentamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-2-2</td><td>Addgene</td><td>98256</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla gentamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-2-4</td><td>Addgene</td><td>98257</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistente alla gentamicina (25 ug/ml)</td></tr><tr><td><forte>ceppi batterici</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agrobacterium tumefaciens GV3101</td><td></td><td></td><td>Csaba Koncz e Jeff Schell, Il promotore del gene TL-DNA 5 controlla l'espressione tessuto-specifica dei geni chimerici trasportati da un nuovo tipo di vettore binario Agrobacterium. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistente alla gentamicina (50 ug/ml) e alla rifampicina (50 ug/ml)</td></tr><tr><td>Pseudomonas syringae pv. Tomato CUCPB5500</td><td></td><td></td><td>Kvitko, B. H. et al. Le delezioni nel repertorio dei geni effettori di secrezione di tipo III DC3000 del pomodoro pv. di Pseudomonas syringae rivelano una sovrapposizione funzionale tra gli effettori. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistente alla rifampicina (100 ug/ml)</td></tr><tr><td><forte>Componenti del supporto</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><forte>Terreno di germinazione delle piante</forte></td><td></td><td></td><td>Aggiungere 2.165g/L Murashige & Skoog in polvere, 10 g/L di saccarosio in acqua. Portare a pH 5,8 e aggiungere 2,2 g/L di phytagel. Autocalve.</td></tr><tr><td>Murashige & Skoog medium con vitamine</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td>Conservare a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169<</td><td></td></tr><tr><td>strong>LB media</td><td></td><td></td><td>Aggiungere 10 g/L di triptone, 5 g/L di estratto di lievito, 10 g/L di NaCl all'acqua. Per i terreni solidi, aggiungere 15 g/L di micro agar. Autoclave. Lasciare raffreddare la soluzione a 55 gradi C, e aggiungere antibiotico se necessario.</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>BD Bioscience</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>BD Bioscience</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0520</td><td></td></tr><tr><td>Micro agar</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>King's B media</td><td></td><td></td><td>10 g/L di proteasi peptone #2, 1,5 g/L di K2HPO4, 15 g/L di agar in acqua. Autoclave. Raffreddare a 55 gradi C e aggiungere al terreno 15 ml/L di glicerolo sterile, 5 ml/L di MgSO4. Aggiungi antibiotici se necessario.</td></tr><tr><td>Proteoso peptone</td><td>BD Bioscience</td><td>212120</td><td></td></tr><tr><td>Anidro K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551128 USP</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G1345</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Bioscience</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td><forte>Mezzi liquidi di mannitolo-glutammato (MG) </forte></td><td></td><td></td><td>Aggiungere 10 g/L di mannitolo, 2 g/L di acido L-glutammico, 0,5 g/L di KH2PO4, 0,2 g/L di NaCl e 0,2 g/L di MgSO4 all'acqua. Regolare a pH 7</td></tr><tr><td>Mannitolo</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0803</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-glutammico</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0707</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>Tampone</td><td></td><td></td> di infiltrazione <td>10 mM MES (acido 2-(N-morfolino)-etano solfonico), 10 mM MgCl2, 150 &; M acetosiringone. pH 5,6; Preparare un nuovo tampone prima dell'uso.</td></tr><tr><td>MES</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503</td><td>Preparare 100 mM (pH 5,6) di brodo in acqua. Filtro sterilizzare.</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Preparare 100 mM di stock in acqua. Autoclave.</td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td>Preparare 150 mM di stock in DMSO.</td></tr><tr><td>Microscopio confocale attrezzature/materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr> Sistema <tr><td>confocale a scansione laser 710</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio observer Z1 microscopio invertito</td><td>Carl Zeiss</td> Ioduro di <td></td><td></td></tr><tr><td>propidio</td><td>ThermoFisher</td><td>P1304MP</td><td></td></tr></tbody></table>

proteina fluorescente verde sistema di visualizzare gli effettori consegnati dai batteri durante l'infezione split

Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

Batteri, uno dei più importanti agenti causativi di varie malattie delle piante, secernono una serie di proteine effettrici nella cellula ospite pianta di sovvertire il sistema immunitario di pianta. Durante l'infezione effettori citoplasmatici sono consegnati al cytosol host tramite un tipo sistema di secrezione di III (T3SS). Dopo consegna nella cellula della pianta, il effector(s) gli obiettivi i comparti specifici per modulare i processi di cellula ospitante per la sopravvivenza e la replica dell'agente patogeno. Anche se ci sono state alcune ricerche sulla localizzazione subcellulare delle proteine effettrici nelle cellule ospiti per capire la loro funzione nella patogenicità utilizzando proteine fluorescenti, studio della dinamica degli effettori iniettati direttamente da batteri è stato impegnativo a causa di incompatibilità tra la T3SS e proteine fluorescenti.
Qui, descriviamo il nostro metodo recente di un sistema di proteina fluorescente verde superfolder di Spalato ottimizzato (sfGFPOPT) per visualizzare la localizzazione di effettori tramito il T3SS batterica nella cellula ospite. Il sfGFP11 (th 11 β-filo di sfGFP)-taggati effettrici secernuta attraverso la T3SS possono essere assemblato con un organello specifici mirato sfGFP1-10OPT (1-10th . β-filo di sfGFP) leader per l'emissione di fluorescenza nel sito. Questo protocollo fornisce una procedura per visualizzare il segnale di fluorescenza sfGFP ricostituito con una proteina da Pseudomonas syringae in un organello particolare nelle piante di Arabidopsis e Nicotiana benthamiana .

La struttura del β-barilotto della GFP è composta da undici filamenti β e può essere diviso in due frammenti, il filo dith di 1-10 (GFP1-10OPT) e il filo dith (GFP11) 11. Anche se nessuno dei due frammenti fluorescenti da soli, sfGFP auto-assemblati è in grado di emettere fluorescenza quando i due frammenti presenti nelle immediate vicinanze (Figura 1A). In questo sistema, sfGFP1-10OPT-esprimendo di Arabidopsis<...

Approcci basati sulla proteina fluorescenti per monitorare gli effettori secernuti dai batteri nelle cellule ospiti sono impegnativi. Ciò è dovuto all'incompatibilità tra proteine fluorescenti e il sistema di secrezione di tipo III. Qui, un sistema GFP superfolder ottimizzato split viene utilizzato per la visualizzazione degli effettori secernuta dai batteri nella cellula della pianta ospite.

Proteina fluorescente verde sistema di visualizzare gli effettori consegnati dai batteri durante l'infezione Split

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'interazione pianta-microbi, come ad esempio il modo in cui i batteri patogeni possono disturbare le condizioni ottimali delle loro cellule vegetali ospiti utilizzando proteine chiamate effettori secrete nelle cellule vegetali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la proteina effettrice batterica viene espressa nella cellula batterica utilizzando il loro sistema di espressione nativo e quindi consegnata alla cellula vegetale attraverso il sistema di secrezione batterica di tipo III. Per iniziare questa procedura, preparare le piante di Nicotiana benthamiana e Arabidopsis thaliana come indicato nel protocollo di testo.Successivamente, utilizzare l'elettroporazione standard per trasformare il gene portatore del plasmide e l'effettore fusi al tag sfGFP11 nel ceppo CUCPB5500 di pomodoro patovare Pseudomonas syringae. Il punto temporale ottimale e il livello di espressione, o sfGFP ricostituibile, dipendono in realtà dalla proteina effettrice. Si consiglia di ottimizzare le condizioni di inoculazione o di osservazione.Distribuire delicatamente le cellule batteriche trasformate sulla superficie delle piastre

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Fonte: Lee, H. et. al., Sistema proteico fluorescente verde diviso per visualizzare gli effettori rilasciati dai batteri durante l'infezione. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra un metodo per monitorare l'infezione batterica e la somministrazione di proteine effettrici nelle cellule vegetali utilizzando la complementazione della proteina fluorescente verde (sfGFP) con la microscopia confocale. L'approccio consente una visualizzazione precisa della traslocazione dell'effettore nel citosol...

Monitoraggio dell'infezione batterica e della consegna di proteine effettrici nelle cellule vegetali

Questo articolo descrive i metodi per la sintesi e l'etichettatura fluorescente di nanoparticelle (NP). Le NP sono stati applicati in esperimenti di pulse-chase di etichettare il sistema endo-lisosomiale di cellule eucariotiche. Manipolazione del sistema endo-lisosomiale dalle attività del patogeno intracellulare Salmonella enterica sono state seguite da imaging cellulare dal vivo e quantificato.

Applicazione di nanoparticelle fluorescenti per studiare rimodellamento del sistema Endo-lisosomiale da batteri intracellulari

L'elettroporazione è stata utilizzata per inserire proteine effettrici di virulenza batterica purificate direttamente nelle cellule eucariotiche viventi. La localizzazione delle proteine è stata monitorata mediante microscopia confocale a immunofluorescenza. Questo metodo consente studi sul traffico, la funzione e le interazioni proteina-proteina utilizzando proteine esogene attive, evitando la necessità di espressione eterologa nelle cellule eucariotiche.

Elettroporazione di effettori batterici funzionali in cellule di mammifero

La traslocazione dell'effettore nelle cellule ospiti attraverso un sistema di secrezione di tipo III è una strategia di virulenza comune tra i batteri gram-negativi. È stato applicato un saggio basato sulla fusione di effettori beta-lattamasi per l'analisi quantitativa della traslocazione. Nelle cellule infette da Yersinia, la conversione di un reporter FRET da parte della beta-lattamasi viene monitorata mediante microscopia a scansione laser.

Analisi di<em&gt; Yersinia enterocolitica</em&gt; Effector traslocazione in cellule ospiti Utilizzando beta-lattamasi Effector Fusions

Indagare le interazioni tra batteri patogeni ei loro ospiti è un'area importante della ricerca biologica. Qui, descriviamo le tecniche necessarie per misurare effettrici traslocazione da Coxiella burnetii durante siRNA silenziamento genico mediante substrato Blam.

Applicando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) per esaminare Effector Translocation efficienza da<em&gt; Burnetii Coxiella</em&gt; Durante siRNA Silencing

Qui, presentiamo un protocollo per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del mouse usando una maggiore fluorescenza verde Escherichia coliche esprimono proteine.

Utilizzando Enhanced fluorescenza verde che esprimono proteine Escherichia Coli per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del Mouse

Qui descritto è un metodo per l'analisi di espressione genica batterica nei tessuti animali ad un livello cellulare. Questo metodo fornisce una risorsa per studiare la diversità fenotipica che si verificano all'interno di una popolazione batterica in risposta all'ambiente del tessuto durante l'infezione.

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Questo protocollo di imaging cellulare vivo-batterico consente di vedere le interazioni tra più specie batteriche a livello di singola cellula nel tempo. L'imaging time-lapse consente l'osservazione di ogni specie batterica in monocultura o cocoltura per interrogare le interazioni interspecie in comunità batteriche multispecie, tra cui la motilità e la vitalità delle singole cellule.

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Questo articolo fornisce un protocollo semplice e chiaro per marcare gli effettori secreti da Salmonella utilizzando l'espansione del codice genetico (GCE) in modo specifico per il sito e visualizzare la localizzazione subcellulare delle proteine secrete nelle cellule HeLa utilizzando la microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM)...

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Proteina fluorescente verde sistema di visualizzare gli effettori consegnati dai batteri durante l'infezione Split

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