Microscopia a riflessione interferenziale per la visualizzazione senza marcatura della dinamica dei microtubuli

La microscopia a riflessione per interferenza consente di visualizzare microtubuli che crescono e si restringono dinamicamente.

Fissare le strisce di paraffina su un vetrino coprioggetti e posizionare sopra un vetrino coprioggetti leggermente più piccolo. Scaldare per sciogliere la paraffina, formando un canale sigillato. Pipettare una soluzione contenente anticorpi attraverso il canale. Gli anticorpi si attaccano alla superficie del vetrino coprioggetti. Aggiungere una soluzione bloccante, bloccando le regioni non legate agli anticorpi e impedendo il legame non specifico della proteina.

Posizionare il vetrino coprioggetti sul tavolino del microscopio. Impostare il riscaldatore del campione su una temperatura che faciliti la crescita dei microtubuli.

Pipetta di semi di microtubuli stabilizzati con un trifosfato di guanosina non idrolizzabile, GTP, analogo. I semi si legano al vetrino coprioggetti rivestito di anticorpo. Aggiungere un tampone contenente tubulina non marcata, GTP e agenti riducenti.

A temperatura e condizioni tampone ottimali, i semi agiscono come siti di nucleazione, consentendo il legame della tubulina non marcata e la crescita dei microtubuli.

Inizia l'imaging. La luce incidente si focalizza attraverso un diaframma di apertura su un divisore di fascio che riflette parzialmente la luce verso l'obiettivo, illuminando il campione. L'interfaccia vetro-tampone del vetrino riflettendo parzialmente la luce incidente. La restante luce incidente passa attraverso e viene riflessa alle interfacce tampone-microtubuli.

In base alla distanza tra microtubuli e vetrini, i raggi riflessi dalle due interfacce interferiscono, producendo interferenze costruttive (raggi che si combinano per produrre un segnale luminoso) o interferenze distruttive (raggi che si annullano per produrre un segnale scuro).

Visualizza i microtubuli come immagini ad alto contrasto. Cattura immagini time-lapse, rilevando la crescita e il restringimento dei microtubuli.

Per iniziare, inserire uno specchio 50/50 nella ruota portafiltri di un microscopio a fluorescenza utilizzando un cubo filtrante appropriato. Maneggia lo specchio con cura poiché spesso hanno un rivestimento antiriflesso. Passare a un obiettivo ad alto ingrandimento che abbia anche un'apertura numerica elevata. Quello mostrato qui è un obiettivo a olio 100x con un'apertura numerica di 1,3.

Quindi, usa una lama di rasoio e un vetrino da microscopio come bordo dritto per tagliare strisce larghe 3 millimetri di pellicola di plastica di paraffina. Posizionare due delle strisce di pellicola di paraffina di plastica a 3 millimetri di distanza l'una dall'altra su un vetrino coprioggetti pulito da 22 x 22 millimetri. Quindi, posiziona un vetrino coprioggetti di 18 x 18 millimetri sopra le strisce per formare un canale.

Trasferire il vetrino coprioggetti in un blocco termico a 100 gradi Celsius per 10-30 secondi affinché la pellicola di paraffina formi un canale sigillato. Utilizzando una pipetta, versare 50 microgrammi per millilitro di un anticorpo anti-rodamina per perfusione e incubare il vetrino per 10 minuti.

Dopo l'incubazione, lavare il canale cinque volte utilizzando BRB80 filtrato. Quindi, versare il polossamero 407 all'1% nel BRB80 filtrato per bloccare la superficie contro il legame aspecifico e incubare il vetrino per 10 minuti. Anche in questo caso, lavare il canale cinque volte utilizzando BRB80 filtrato.

Per evitare che il campione si secchi, aggiungere due goccioline del BRB80 filtrato alle estremità del canale e aggiungere altro tampone se necessario. Posizionare il campione sul tavolino del microscopio e accendere la sorgente luminosa di epi-illuminazione. Concentrarsi sul bordo della pellicola di paraffina per trovare la superficie del campione, quindi spostare il campo per impostare la vista al centro della camera. Osserverai più superfici mentre l'obiettivo viene spostato su e giù a causa della riflessione posteriore della luce dall'ottica all'interno del percorso ottico.

Quindi, centrare il diaframma di campo nel campo visivo chiudendolo a metà e utilizzando le viti di regolazione Una volta che il diaframma è allineato correttamente, riaprirlo. Quindi, fai scorrere la lente Bertrand per visualizzare il piano focale posteriore, noto anche come pupilla d'uscita dell'obiettivo.

Chiudere il diaframma di apertura oltre i bordi della pupilla di uscita e utilizzare le viti di regolazione per centrare il diaframma di apertura rispetto alla pupilla di uscita. Ricontrollare aprendo il diaframma di apertura e facendo combaciare i suoi bordi con quelli della pupilla d'uscita. Quindi, impostare il diaframma di apertura a circa 2/3 dell'apertura numerica dell'obiettivo.

Per visualizzare la dinamica dei microtubuli utilizzando la tubulina cerebrale, iniziare impostando la temperatura del riscaldatore del campione a 37 gradi Celsius. Utilizzando una pipetta, versare 10 microlitri di semi di microtubuli stabilizzati con GMPCPP e monitorarli mentre si legano alla superficie mediante imaging della superficie dal vivo. Una volta che da 10 a 20 semi sono legati all'interno del campo visivo, lavare il campione utilizzando il doppio del volume del canale del BRB80 preriscaldato e filtrato.

Successivamente, versare 10 microlitri della miscela di polimerizzazione.

Per misurare la crescita dei microtubuli, impostare un time-lapse utilizzando il software di acquisizione per acquisire un'immagine ogni 5 secondi per 15 minuti. Migliora il contrasto acquisendo un'immagine media di 10 in ogni punto temporale. Acquisire le immagini di sfondo come illustrato nella sezione precedente. Calcola la mediana andando su Immagine, selezionando Pila, quindi Progetto Z, quindi Mediana. Sottrai lo sfondo corrispondente andando su Elabora, andando su Calcolatore di immagini e scegliendo Sottrai dal menu a discesa. Assicurati che l'opzione del risultato float a 32 bit sia selezionata.

Per il restringimento dei microtubuli, acquisire immagini a 100 fotogrammi al secondo impostando il ritardo su zero e mantenendo il tempo di esposizione a 10 millisecondi.