Quantificazione della formazione di increspature della membrana mediante microscopia elettronica a scansione

Gli stimolatori esterni attivano le cellule e inducono la protrusione tridimensionale circolare della membrana, o formazione di increspature della membrana, essenziali per varie attività cellulari.

Per visualizzare la formazione di increspature della membrana, iniziare con una piastra a più pozzetti contenente un vetrino coprioggetti alla base. La parte superiore del vetrino coprioggetto ha macrofagi coltivati.

Trattare questi macrofagi con molecole stimolatrici che attivano le cellule, facilitando la riorganizzazione del citoscheletro e la formazione della protrusione della membrana. Sovrapporre le cellule con una soluzione fissativa, reticolando le proteine e preservando la struttura cellulare.

Trattare i macrofagi fissi con concentrazioni crescenti di alcol per una completa disidratazione. Essiccare questi macrofagi utilizzando un essiccatore a punto critico, eliminando qualsiasi traccia di acqua per un migliore imaging.

Montare il vetrino coprioggetti su un supporto per microscopia elettronica a scansione, o SEM, utilizzando nastro conduttivo. Rivestire il vetrino coprioggetti contenente macrofagi con un sottile strato di metallo, garantendo una buona conduttività elettronica durante l'imaging.

Posizionare il vetrino coprioggetti nella camera SEM. Focalizzare il fascio di elettroni sul vetrino coprioggetti. Il fascio di elettroni colpisce la membrana del macrofago rivestito di metallo, causando la generazione di elettroni secondari a bassa energia dalla superficie della membrana.

Le sporgenze tridimensionali diffondono gli elettroni in modo diverso rispetto al resto della membrana, evidenziando queste caratteristiche sulla superficie cellulare. Il rivelatore raccoglie gli elettroni dispersi da varie regioni della superficie cellulare, generando un'immagine di contrasto.

Nell'immagine SEM, i macrofagi appaiono più scuri con sporgenze circolari luminose sulla superficie, confermando la formazione di volant.

Iniziare posizionando vetrini coprioggetti sterili nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti utilizzando una pinza autoclavata. Quindi, seminare i macrofagi RAW 264.7 sui vetrini coprioggetti a una densità di^10-6 cellule per millilitro e incubare la piastra per una notte in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Il giorno seguente, sostituire il terreno in ogni pozzetto con 500 microlitri di terreno completo fresco, quindi pretrattare i macrofagi per 30 minuti con un veicolo di controllo come il DMSO o un inibitore della macropinocitosi come l'EIPA. Successivamente, per favorire l'arruffamento della membrana, trattare le cellule per 30 minuti con stimolatori della macropinocitosi, come una soluzione di PMA 1-micromolare o 100 nanogrammi per millilitro di fattore stimolante le colonie di macrofagi.

Per fissare le celle per la microscopia elettronica a scansione, aspirare il terreno dai pozzetti e lavare due volte i vetrini coprioggetti con PBS ghiacciato. Quindi, incubare i vetrini coprioggetti in un fissativo per 30 minuti a temperatura ambiente, seguiti da un'incubazione notturna a 4 gradi Celsius.

Il giorno seguente, senza disturbare il monostrato cellulare, lavare delicatamente, e poi, incubare i vetrini coprioggetti in 500 microlitri di cacodilato di sodio molare 0,1 per 15 minuti. Dopo due lavaggi con 500 microlitri di acqua distillata, lavare i vetrini coprioggetti due volte in 500 microlitri di una serie di etanolo graduato con un'incubazione di 10 minuti in ogni lavaggio.

Per eseguire l'asciugatura dei punti critici, posizionare i vetrini coprioggetti in un essiccatore per punti critici e coprirli con etanolo al 100%, quindi premere il pulsante di accensione e aprire il serbatoio dell'anidride carbonica. Premere il pulsante Cool per circa 30 secondi fino a quando la temperatura non scende a 0 gradi Celsius. Quindi, premere il pulsante Fill finché non appare una bolla nella finestra della camera.

Quindi, premere il pulsante di spurgo fino a quando l'odore di etanolo dallo scarico di spurgo scompare. Quindi, premere nuovamente il pulsante Freddo, fino a quando la temperatura non scende a 0 gradi Celsius. Premere nuovamente i pulsanti Riempi ed Elimina per disattivarli. Quindi, chiudere il serbatoio dell'anidride carbonica. Premere nuovamente il pulsante Freddo per spegnerlo, quindi premere il pulsante Calore. Imposta la temperatura a 42 gradi Celsius e la pressione a 1.200 libbre per pollice quadrato.

Una volta che la pressione e la temperatura si sono stabilizzate, premere il pulsante di spurgo per consentire alla pressione di diminuire lentamente. Una volta che la pressione della camera raggiunge i 150 libbre per pollice quadrato, premere il pulsante di sfiato e attendere che la pressione scenda a 0 libbre per pollice quadrato. Spegnere l'asciugatrice a punti critici e rimuovere i vetrini.

Quindi, utilizzando le linguette adesive al carbonio, montare i vetrini coprioggetti sui supporti per campioni in alluminio per la microscopia elettronica a scansione. Quindi, procedere al rivestimento sputtering utilizzando oro o palladio in un rivestimento sputter.

Accendere il pulsante di accensione della verniciatrice per polverizzazione catodica . Dopo che il vuoto ha raggiunto i 30 millitori, lavare la camera per rimuovere l'umidità e l'aria spegnendo l'interruttore del gas e ruotando la valvola del gas fine in senso antiorario. Una volta che il vuoto aumenta a 200 millitorr, spegnere l'interruttore del gas e attendere che il vuoto raggiunga i 30 millitorrs, quindi lavare nuovamente la camera per rimuovere l'umidità e l'aria come dimostrato. Dopo aver lavato la camera tre volte, premere il pulsante Timer e regolare la manopola Voltage fino a quando l'indicatore non legge 10 milliampere. Quindi, rimuovere i vetrini coprioggetti rivestiti dalla camera.

Per visualizzare e quantificare le increspature della membrana, inserire i vetrini coprioggetti del campione nella camera di un microscopio elettronico a scansione. Chiudere la porta e premere il pulsante Evac. Aprire il software operativo del microscopio e impostare la tensione di accelerazione a 15 kilovolt e la distanza di lavoro a 10 millimetri. Premi il pulsante Coordinate e spostati intorno al controller finché le celle non appaiono al centro dello schermo di osservazione. Impostare l'ingrandimento su 3500x e acquisire l'immagine del campione facendo clic sul pulsante Foto.