Flusso di lavoro di tomografia ad array per l'acquisizione mirata di informazioni sul volume utilizzando la microscopia elettronica a scansione

L'analisi al microscopio elettronico è spesso complessa. Riteniamo che il nostro protocollo faciliti l'elaborazione e l'acquisizione dei dati EM dall'ampia superficie del campione e dal volume intermedio. Il nostro protocollo aiuta a trovare le strutture target nelle sezioni seriali.

La registrazione dei dati è limitata a ciò che è necessario. Rispetto all'acquisizione dei dati in blocchi di tessuto intero, il tempo di registrazione è ridotto e l'analisi dei dati più semplice. Data la generale facilità dell'approccio, riteniamo che possa essere utilizzato per affrontare non solo questioni scientifiche, ma anche come strumento diagnostico.

Per generare un array per l'analisi, prima bloccare il campione su un supporto per ultramicrotomia e utilizzare una lama di rasoio per tagliare approssimativamente la resina attorno al campione. Utilizzare uno strumento di taglio diamantato per tagliare finemente il campione e utilizzare coltelli di taglio con inclinazione di 20 o 90 gradi per garantire che le superfici superiore e inferiore del blocco siano parallele al tagliente del coltello. Mescolare xilene e colla in proporzione 3:1 e utilizzare una ciglia attaccata a uno stuzzicadenti per applicare la miscela sui bordi superiore e inferiore del blocco tagliato.

Mentre la miscela si sta asciugando, utilizzare uno strumento di chiusura del wafer per tagliare un pezzo di wafer alla dimensione appropriata per l'analisi. Pulire il wafer in acqua distillata per risciacquare via eventuali detriti e pulire la superficie con plasma dopo che il wafer è asciutto. Per preparare un coltello da tomografia array, utilizzare nastro adesivo schiumoso per attaccare un ago sul fondo di un coltello histo jumbo e posizionare il coltello nel supporto ultra microtome a zero gradi.

Regolare il bordo del coltello parallelamente alla superficie del blocco e portare il blocco tagliato sul bordo del coltello in una posizione pronta per il sezionamento. Posizionare il wafer pulito nella bacinella del coltello e riempire la bacinella con acqua allo stesso livello del bordo del coltello, quindi lasciare che il bordo diamantato del coltello umidifichi correttamente, usando la siringa attaccata per aggiungere o prelevare l'acqua secondo necessità. Per il sezionamento dell'array, impostare il microtomo su un intervallo di taglio da 50 a 100 nanometri e una velocità di taglio da 6 a 1 millimetro al secondo e iniziare il sezionamento per ottenere un nastro abbastanza lungo da coprire un volume Z mirato.

A seconda delle dimensioni del blocco, dell'omogeneità del tessuto e del tipo di resina, il nastro sarà approssimativamente dritto. Usa una punta pulita e non appiccicosa di una ciglia per staccare i nastri dal bordo del coltello. Usa le ciglia per spostare delicatamente il nastro al centro del supporto.

Il cloroformio o una penna riscaldante possono essere utilizzati per allungare la sezione, se necessario. Dopo lo stretching, ritrarre la siringa per iniziare a drenare l'acqua. Per nastri più delicati o una retrazione dell'acqua più lenta, staccare la siringa dal tubo per far gocciolare l'acqua.

Quando il livello dell'acqua raggiunge il livello del wafer, spingere delicatamente il nastro al centro del bacino e continuare a drenare fino a quando tutta l'acqua rimanente non viene completamente rimossa dal bacino. Lasciare asciugare il wafer in un ambiente pulito. L'essiccazione richiede circa 30 minuti.

Quando il campione è completamente asciutto, trasferire l'array in una scatola ben chiusa per proteggerlo dalla contaminazione da sporco. E metti la scatola in un forno a 60 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Per acquisire una mappa panoramica delle immagini SEM che rivela le posizioni delle sezioni sul wafer, utilizzare la telecamera ottica integrata per acquisire un'immagine SEM che copre un nastro di sezioni.

Per creare un mosaico, fare clic e trascinare l'immagine della fotocamera del campione e avviare l'acquisizione automatica. Acquisisci panoramiche a risoluzione più elevata per trovare le strutture di destinazione. Se è necessario creare solo poche sezioni, utilizzare il visualizzatore zoomabile per visualizzare le immagini acquisite nelle posizioni originali.

Una volta identificata una sezione che deve essere ripresa ad alta risoluzione, fare clic e trascinare per creare un'area di imaging, quindi selezionare Impostazioni di imaging ad alta risoluzione e memorizzare le impostazioni in un modello Per trovare eventi rari particolarmente piccoli o difficili da rilevare, utilizzare le impostazioni di imaging ad alta risoluzione su ogni 10a sezione o su una sezione per barra multifunzione per creare manualmente un'area di imaging e acquisire le immagini. Quindi rivedere le immagini e contrassegnare le sezioni che contengono la regione di interesse. Per acquisire più di 10 sezioni consecutive, utilizza il cercatore di sezioni per individuare automaticamente tutte le sezioni.

Se le immagini di panoramica non mostrano chiare regioni di interesse, acquisire immagini ad alta risoluzione delle sezioni e utilizzare la funzione di anteprima della sezione per creare e acquisire automaticamente le immagini. Per determinare le impostazioni di imaging ottimali, attivare l'imaging dal vivo nel software di controllo del microscopio e passare a una regione di interesse, quindi regolare le impostazioni di imaging fino a quando le immagini non mostrano chiare regioni di interesse, ma senza un'acquisizione di immagini eccessivamente lunga, secondo le linee guida del produttore. Per ottimizzare il posizionamento delle regioni di imaging su sezioni consecutive, ingrandire l'immagine di interesse e fare clic su Avvia perfezionamento posizione per aumentare la precisione delle posizioni delle sezioni registrate.

Per definire un'area di imaging, fare clic e trascinare su qualsiasi sezione tenendo premuto il tasto Alt e selezionare Crea matrice set di riquadri dal menu di scelta rapida a comparsa. Il software creerà regioni di imaging nella stessa posizione relativa in tutte le sezioni che sono state trovate o precedentemente contrassegnate. Quindi imposta il numero di pixel, le dimensioni dei pixel, il layout delle piastrelle e il tempo di permanenza dei pixel in ogni serie di immagini in base alle esigenze.

Per configurare la funzione automatica, creare una serie di immagini separata per le funzioni automatiche, come illustrato, e spostare la serie di immagini in una posizione sulla sezione che contiene strutture a contrasto elevato. Impostare la serie di immagini su 1024 x 884 pixel e selezionare una dimensione in pixel corrispondente alla risoluzione più alta utilizzata nella serie di immagini. Nell'elenco delle funzioni automatiche, selezionare Messa a fuoco automatica e Auto stigmator.

Selezionare Bisezione nei controlli della sequenza di acquisizione e verificare che l'immagine della funzione automatica sia il primo elemento dell'elenco, quindi fare clic su Acquisisci tutto per avviare l'acquisizione dell'immagine. Quando tutte le serie di immagini sono state create e configurate, la serie verrà elencata in una coda di lavoro. L'acquisizione a bassa risoluzione può essere eseguita manualmente o automaticamente direttamente su parti selezionate della sezione o su un'intera sezione utilizzando immagini singole o a mosaico, seguite da cuciture.

Le immagini dell'area selezionata possono quindi essere acquisite utilizzando parametri ad alta risoluzione per visualizzare mitocondri, nuclei e microvilli, ad esempio, Dopo aver selezionato l'acquisizione automatica delle mappe di mosaico risolte, diverse regioni di interesse possono essere ritagliate o utilizzate per definire ulteriori aree di imaging locale all'interno delle regioni. Sebbene diversi tipi di cellule specializzate nell'intestino di Drosophila siano distribuiti in modo casuale, possono essere distinti visivamente dopo lo screening delle immagini utilizzando parametri ad alta risoluzione, sia da singole sezioni che come raccolta di immagini seriali. Dopo l'allineamento, gli stack possono essere renderizzati utilizzando diverse soluzioni software.

L'analisi della tomografia ad array consente di generare molte sezioni sequenziali sul singolo wafer e di essere schermate utilizzando parametri a bassa risoluzione per localizzare le aree generali di interesse. Queste aree possono essere mirate per ulteriori analisi utilizzando parametri di acquisizione avanzati. Ad esempio, le divisioni mitotiche nel notum non sono facili da localizzare a livello ultra-strutturale, poiché le cellule sono relativamente grandi rispetto alla zona di abscissione.

Utilizzando questo metodo, tuttavia, le immagini di panoramica automatiche a media risoluzione dei salti da 20 a 40 sezioni possono essere utilizzate per localizzare le celle divisorie. La procedura di tomografia ad array fornisce un'analisi dei dati al microscopio elettronico più semplice. Incoraggiamo gli spettatori a investire nella padronanza della rigenerazione e familiarizzare con il flusso di lavoro relativo alle mappe Nella nostra esperienza, pochi argomenti di ricerca richiedono l'analisi ultra-strutturale di interi animali o interi organi.

Il nostro metodo aiuta con la rapida localizzazione delle cellule e dei loro partner di interazione nei tessuti.