Visualizzazione del DNA ricombinante e Complessi proteina usando la microscopia a forza atomica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare biomolecole come il DNA e le proteine in tamponi acquosi in tempo reale utilizzando la microscopia a forza atomica. Ciò si ottiene preparando prima le biomolecole da visualizzare. Successivamente, viene impostato il microscopio a forza atomica e viene posizionata una sonda a sbalzo FM.

La superficie del campione e le biomolecole di interesse vengono quindi visualizzate e analizzate. In definitiva, si possono ottenere risultati che mostrano le dimensioni, la quantità e l'organizzazione generale del DNA e delle proteine e complessi biomolecolari eterogenei in condizioni tamponate attraverso la microscopia a forza atomica. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo degli chaperoni molecolari, come ad esempio qual è la geometria STO degli chaperoni e il complesso degli chaperoni cos per un cliente.

La dimostrazione visiva di questo metodo è vantaggiosa in quanto le fasi di preparazione della sonda a leva A FM e Kent possono essere difficili da apprendere dalle istruzioni stampate, in gran parte a causa delle complessità associate alla loro manipolazione fisica. A dimostrare la procedura saranno Morgan Shannon e John Gertz, due studenti del mio laboratorio, per iniziare a isolare le molecole di proteina o DNA da visualizzare e sospenderle in un tampone acquoso. Dopo aver confermato la purezza del campione, incubarlo in un tampone di assorbimento FM su ghiaccio per favorire l'adesione del campione alla mica.

Per i campioni di proteine, utilizzare un tampone cumuli da 10 millimolari. E per il tampone contenente magnesio DNAA composto da 10 millimolari di tris, pH 7,5 e 10 millimolari di cloruro di sodio, due millimolari di cloruro di magnesio sono adatti per montare la sonda A FM. Posizionare il supporto della sonda a celle liquide sulla docking station di installazione a sbalzo corrispondente.

Individuare il cantilever lungo e spesso della sonda a leva in nitruro affilato da utilizzare per l'imaging. Trasferirlo con cautela nel supporto della sonda a celle liquide, assicurandosi che la punta rimanga in posizione verticale. Quindi, esaminare il cantilever al microscopio ottico per assicurarsi che sia intatto e posizionato correttamente nel supporto della sonda a celle liquide.

Quindi rimuovere con cautela la testa FM dal gruppo a coda di rondine dello strumento serrando la vite di bloccaggio della testa neurale. Capovolgere la testa FM e spingere con decisione il supporto della sonda a celle liquide sui quattro pin alla base della testa FM a. Infine, riposizionare con cautela la testa FM nello strumento di montaggio della coda.

Per preparare ulteriormente l'FM prima dell'imaging dei campioni, spostare le manopole del microscopio ottico integrato per individuare la punta a sbalzo, regolare le frecce su e giù del controller ottico sul software per mettere a fuoco la punta a sbalzo. Utilizzare le manopole di regolazione del laser per allineare il laser alla punta del cantilever. Questo è uno dei passaggi tecnicamente più impegnativi del protocollo: il posizionamento viene eseguito manualmente e richiede una regolazione precisa della manopola.

Un attento monitoraggio del laser nel punto di riflessione e nel punto di illuminazione aumenta la probabilità di un allineamento riuscito. Quindi, regolare le manopole del fotorivelatore sulla testa FM per centrare il fotorilevatore. Posizionare un foglio di MICA appena tagliato attaccato a un disco metallico per campioni FM sul supporto del campione magnetizzato sopra la piastra di supporto A FM.

Ruotare la piastra di supporto FM in modo che il disco del campione sia posizionato per l'imaging iniziale. Utilizzare il controllo della superficie di messa a fuoco del software dello strumento per spostare la testa FM verso il basso verso la superficie del disco del campione MICA. Fino a quando le caratteristiche distinte sulla superficie MICA o la riflessione della punta non sono a fuoco, selezionare l'icona della melodia dal software dello strumento e accordare il cantilever.

La frequenza di risonanza delle sonde MSNL o SNL consigliate è compresa tra 20 e 60 kilohertz. Selezionare un offset di picco del 5% per acquisire l'immagine del campione MICA. Innanzitutto, innestare la sonda sulla superficie MICA, impostare la dimensione di scansione iniziale a 10 micrometri e la velocità di scansione a un hertz.

Cattura immagini di scansione complete del campo da 10 micrometri. Quindi ridurre le dimensioni della scansione a cinque uno e 0,5 micrometri e acquisire immagini complete di ciascun campo. Disinnestare la sonda facendo clic una volta sull'icona di disinnesto sul software dello strumento.

Per visualizzare le biomolecole di interesse, mescolare cinque microlitri del campione preparato con 45 microlitri di tampone di assorbimento fresco. Aggiungere con cautela 50 microlitri della biomolecola contenente la soluzione da 0,5 microgrammi per millilitro direttamente sulla superficie delle MICU. Mettere in pausa per cinque minuti per consentire alle biomolecole nel campione di aderire alla superficie del Micah.

Quindi pipettare altri 50-100 microlitri di tampone di assorbimento nel supporto della sonda a celle liquide. Facendo attenzione a non toccare la sonda, una testina FM o MICA con la punta della pipetta, regolare nuovamente il fotorilevatore e riallineare il laser al cantilever se necessario. Quindi utilizzare il software dello strumento per riattivare la sonda.

Aumentare le dimensioni della scansione per identificare le aree di interesse. Una volta completata l'imaging, selezionare più volte l'icona di prelievo sul software dello strumento per disinnestare la sonda. Infine, utilizzare acqua distillata per sciacquare accuratamente il supporto della sonda a celle liquide e il disco del campione.

Quindi provalo con aria compressa. Di seguito è riportato un esempio di immagine A FM. Il substrato di mica fornisce una superficie molecolare piatta su cui il DNA e le proteine possono essere assorbiti.

L'imaging MICA prima dei campioni di biomolecole fornisce un controllo negativo e una valutazione del rumore di imaging. Fornisce inoltre un livello di garanzia che il cantilever sia regolato correttamente e che la successiva imaging del campione avrà successo. Il DNA plasmatico a doppio filamento, presumibilmente super avvolto, è facilmente identificabile dal suo aspetto asimmetrico e dal deposito uniforme sul substrato di Micah, precedentemente insignificante.

Anche i complessi proteici di dimensioni discrete delle particelle sono distinguibili in modo univoco dal substrato di Micah. Le differenze di dimensione delle particelle indicano l'eterogeneità del campione e possono essere utili per approssimare proteine, geometrie stoiche complesse o attività biochimica. La forma diagonale generale e l'orientamento coerente delle particelle proteiche osservate.

Ecco un artefatto di imaging poiché le proteine sarebbero prevedibilmente orientate sul substrato di Micah in modo casuale. Le possibili cause dell'artefatto osservato o di un'anomalia fisica della punta o di un imaging FM a due rapide di una velocità di scansione mentre la convoluzione della punta impedisce la misurazione della lunghezza assoluta, i calcoli della misurazione della lunghezza assoluta nella misurazione dell'altezza degli assi x e Y o degli assi Z e le relative misurazioni X e Y possono comunque essere utili per stimare le proprietà biofisiche delle biomolecole visualizzate. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di regolare accuratamente il cantilever e allineare il fotorilevatore Seguendo questa procedura FM di base.

Altri passaggi, tra cui l'utilizzo di una cellula fluida a scambio tampone, possono essere aggiunti per rispondere a ulteriori domande, come la capacità degli chaperoni molecolari di influenzare il rilascio dei recettori steroidei dai loro elementi di risposta al DNA. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una migliore comprensione di come visualizzare le proteine del DNA e i complessi biomolecolari utilizzando la microscopia a forza atomica in condizioni tamponate.