Name: Preparazione del campione per microscopia a forza atomica Virion singola e imaging a fluorescenza a super risoluzione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-02T21:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 31 s
Description: Impara a preparare vetrini con virioni per microscopia a forza atomica e imaging a super risoluzione. Questo metodo garantisce adesione controllata per analisi strutturali ad alta risoluzione del virus della stomatite vescicolare.

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Ringraziamo il Dr. Till Böcking per il protocollo originale di preparazione a singola molecola. 
Questo lavoro è stato sostenuto dalla sovvenzione NSF 1121972(SS).

<ol><li>Pang, H. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virion+stiffness+regulates+immature+HIV-1+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">Virion stiffness regulates immature HIV-1 entry.</a> Retrovirology. 10, 4(2013).</li>
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<li>Elenko, M. P., Szostak, J. W., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+binding+experiments+on+long+time+scales%5BTitle%5D)+AND+%22Rev.+Sci.+Instrum%22%5BJournal%5D)">Single-molecule binding experiments on long time scales.</a> Rev. Sci. Instrum. 81, (2010).</li>
<li>van Oijen, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Molecule+Kinetics+of+%CE%BB+Exonuclease+Reveal+Base+Dependence+and+Dynamic+Disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-Molecule Kinetics of λ Exonuclease Reveal Base Dependence and Dynamic Disorder.</a> Science. 301, 1235-1238 (2003).</li>
<li>Böcking, T., Aguet, F., Harrison, S. C., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+a+molecular+disassemblase+reveals+the+mechanism+of+Hsc70-driven+clathrin+uncoating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of a molecular disassemblase reveals the mechanism of Hsc70-driven clathrin uncoating.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 18, 295-301 (2011).</li>
<li>Cocucci, E., Aguet, F., Boulant, S., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+First+Five+Seconds+in+the+Life+of+a+Clathrin-Coated+Pit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The First Five Seconds in the Life of a Clathrin-Coated Pit.</a> Cell. 150, 495-507 (2012).</li>
<li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> 3, 793-795 (2006).</li>
<li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li>
<li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li>
<li>Juette, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+sub-100+nm+resolution+fluorescence+microscopy+of+thick+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples.</a> Nat. Methods. 5, 527-529 (2008).</li>
<li>Xu, K., Zhong, G., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin%2C+Spectrin%2C+and+Associated+Proteins+Form+a+Periodic+Cytoskeletal+Structure+in+Axons%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Actin, Spectrin, and Associated Proteins Form a Periodic Cytoskeletal Structure in Axons.</a> Science. 339, 452-456 (2013).</li>
<li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li>
<li>Hodges, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+packaging+of+polymerases+within+vesicular+stomatitis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Asymmetric packaging of polymerases within vesicular stomatitis virus.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 440, 271-276 (2013).</li>
<li>Lawson, N. D., Stillman, E. A., Whitt, M. A., Rose, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+vesicular+stomatitis+viruses+from+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Recombinant vesicular stomatitis viruses from DNA.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 4477-4481 (1995).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti in questo documento.

L'imaging a virione singolo con AFM e l'imaging a fluorescenza ad alta risoluzione può essere utilizzato come metodologia alternativa alla tomografia CryoEM. Ognuna di queste metodologie ha i suoi punti di forza specifici. Ad esempio AFM può essere fatto su virioni WT senza alcun requisito per etichettare il campione o le proteine virali interne. La posizione delle strutture virali è deconvolta dai loro contributi alle proprietà elastiche del virione.
L'imaging a super-risoluzione virione singola in combinazione con i nuovi approcci genetici inversi virali diventa una tecnica potente per localizzare proteine virali a basso numero di copie20. I virus ricombinanti con la sostituzione delle loro proteine con proteine fuse con proteine fluorescenti possono essere prodotti e purificati utilizzando questi approcci genetici inversi. Sebbene l'imaging a super-risoluzione abbia specificità in parte a causa del tagging genetico, richiede l'uso dei virus mutanti.
AFM e imaging a super risoluzione sono metodi gratuiti che utilizzano preparazioni campione molto simili. I metodi delineati in questo documento, che sono adottati da precedenti test di imaging a singola molecola, consentono l'ancoraggio di singoli virioni con pochi effetti sulla topologia dei virioni.

Le interazioni non specifiche basate sulla carica sono usate abitualmente per l'adesione dei virioni nella microscopia a forza atomica1,2. Queste tecniche funzionano particolarmente bene se utilizzate su virioni non ineveloped con tappi moltorigidi 3-6. Sebbene queste tecniche siano molto efficaci nell'immobilizzare il campione, non impediscono il legame non specifico delle proteine alla superficie. Il legame non specifico può creare un problema quando si tenta di immaginare virioni con AFM e tecniche di fluorescenza a super risoluzione che richiedono incubazioni del campione con vari anticorpi. Qui delineamo un metodo di preparazione del campione per l'immobilizzazione specifica dei virioni.
Il poli(glicole etilenico) (PEG) innestato in poli(L-lisina) (PLL) e adsorbito su una superficie di vetro fornisce un blocco significativo per le interazioni elettrostatiche delle proteine con il vetro7. I test a singola molecola che richiedono l'immobilizzazione di singole molecole su superfici di vetro hanno approfittato di questa proprietà e l'hanno utilizzata per creare una specifica tecnica di immobilizzazione a singola molecola basata su PEG8-10. Questa preparazione è stata utilizzata anche per immobilizzare le gabbie di clatrarina sulla superficiedel vetro 11 e per creare un rivestimento omogeneo di fibronectin per l'adesione delle cellule di controllo 12.
Abbiamo adottato il metodo di preparazione del campione basato sull'adsorbimento PLL-g-PEG sulle superfici di vetro da metodologie di imaging a singola molecola e lo abbiamo applicato all'imaging di singoli virioni del virus della stomatite vescicolare (VSV). Questi virioni singoli sono stati immagini usando la microscopia a forza atomica (AFM). Esperimenti simili sono stati eseguiti anche su perline funzionalizzate come controllo. I virioni sono stati anche immagini dalla microscopia a fluorescenza a super risoluzione, in quanto un anticorpo VSV-G etichettato con Alexa 647 è stato utilizzato per creare un'immagine dell'involucro di singoli virioni. L'imaging fluorescente ad alta risoluzione utilizza la localizzazione di singole molecole per creareun'immagine 13-15. L'imaging bi-planare fPALM consente la localizzazione di singole molecole con 20 nm in piano e risoluzione di 50 nm lungo l'asseottico 15,16. Questa tecnica bi-planare è stata utilizzata per immagini di immagini fluorescenti a super-risoluzione presenti in questo studio. Una tecnica alternativa che ha risultati simili è STORM13,17,18.
Sia l'AFM che le immagini fluorescenti a super-risoluzione di VSV ancorate al vetro dalle procedure descritte in questo documento, hanno mostrato un legame specifico dei virioni al vetro con interazioni minime non specifiche19. Qui presentiamo i protocolli di preparazione del campione per gli esperimenti di imaging fluorescente AFM e super-risoluzione. In breve: le coverlips in vetro pulito sono funzionalizzate adsorbendo una miscela di PLL-g-PEG e PLL-g-PEG-biotina. È tipico che questo film sottile sia progettato per fornire biotina funzionalizzata tra il 15 e il 25% su una superficie rivestita. Le copertine vengono ulteriormente incubate con avidina tetramerica. Un anticorpo virale biotinilato viene quindi utilizzato per creare un sito di legame unico per i virioni. Il legame dell'anticorpo può essere fatto in due modi.
Il primo metodo è ottimizzato per AFM, tuttavia rimane adatto per l'imaging a fluorescenza a super risoluzione. In questo metodo la superficie rivestita di avidina viene trattata con anticorpi biotinilati prima dell'adesione virale. I virioni immobilizzati vengono trattati con anticorpo etichettato Alexa 647 per coprire l'involucro e consentire l'imaging a fluorescenza a super risoluzione dei virioni.
Il secondo metodo è quello di attaccare il virus in soluzione con l'anticorpo biotinilato e l'anticorpo etichettato Alexa 647 prima di aderire ai virus alla superficie trattata con avidina; questo metodo è ottimizzato per esperimenti di imaging a fluorescenza a super risoluzione in cui il recupero dell'involucro virale è importante. Questo metodo ha il vantaggio di consentire un rivestimento anticorpale uniforme sulla superficie virale. L'anticorpo biotinilato può essere miscelato con anticorpi virali etichettati Alexa 647 in rapporti che consentono un sufficiente adsorbimento del virus alla superficie trattata con avidina mantenendo un'alta concentrazione di etichetta fluorescente all'esterno dell'involucro virale. Questi anticorpi virali etichettati Alexa 647 non sono biotinilati e il loro eccesso può essere risciacquato al fine di ridurre il rumore di fondo.

<table><tbody><tr><td>Vetrini coprioggetti in vetro (fPALM)</td><td>Servizi di microscopia elettronica</td><td>72225-01</td><td>Vetrini coprioggetti da 25 mm</td></tr><tr><td>PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotina (20%)&nbsp;</td><td>SuSoS-Stock</td><td></td><td>: 0,5 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>NeutrAvidin proteina legante la biotina</td><td>Invitrogen</td><td>A2666</td><td>Stock: 0,25 mg/ml in PBS</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 capra anti-coniglio IgG (H+L)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A21245</td><td>1:200 in 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10% glicole, pH 7,2 tampone</td></tr><tr><td>&alpha;-VSV-G&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>ab34774</td><td>1:200 in 0,2 M KPO4, 0,15 M NaCl, 10% glicole, tampone pH 7,2</td></tr><tr><td>Gluox</td><td>Sigma</td><td>G2133-250KU</td><td>Glucosio ossidasi tipo sette da Aspergillius&nbsp;</td></tr><tr><td>Catalasi</td><td>Sigma</td><td>C40-100mg</td><td>Catalasi da fegato bovino&nbsp;</td></tr><tr><td>MEA</td><td>Sigma</td><td>30070-10G</td><td>Cisteamina (tampone</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> stock MEA <td>50 mM Tris-HCl (pH 8,0) + 10 mM NaCl + 10% glucosio</td></tr><tr><td>NTE</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris pH 7,4, 100 mM NaCl, 66 mM EDTA</td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer, mini unità di dialisi</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>10.000 MW</td></tr><tr><td>Vetro di copertura del microscopio: 35 CIRCLE #1</td><td>Fisherbrand</td><td>35 CIRCLE #1</td><td></td></tr></tbody></table>

preparazione del campione per microscopia a forza atomica virion singola e imaging a fluorescenza a super risoluzione

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

L'immobilizzazione dei virioni sulle superfici di vetro è un passo fondamentale nell'imaging a virione singolo. Qui presentiamo una tecnica adottata da test di imaging a singola molecola che consente l'adesione di singoli virioni a superfici di vetro con specificità. Questa preparazione si basa sull'innesto della superficie del vetro con una miscela di PLL-g-PEG e PLL-g-PEG-Biotin, aggiungendo uno strato di avidina e infine creando ancoraggi virione attraverso l'attacco di anticorpi specifici del virus biotinilato. Abbiamo applicato questa tecnica in una serie di esperimenti tra cui la microscopia a forza atomica (AFM) e l'imaging a fluorescenza a super risoluzione. Questo metodo di preparazione del campione si traduce in un'adesione di controllo dei virioni alla superficie.

Imaging a virione singolo con AFM:
Il protocollo di preparazione del campione sopra descritto è stato utilizzato per ancorare virioni di tipo selvaggio alla superficie del vetro. I virioni VSV hanno una lunghezza di 180 nm a forma di proiettile e un diametro di 80 nm. Poiché ci sono una varietà di virioni per i quali questa tecnica può essere applicata, il concetto è dimostrato anche qui sulle perline biotinilate a 36 nm. Gli esperimenti AFM risultanti sono riportati nella figura 1. È importante notare che i virioni VSV hanno un modulo di Young inferiore (100 MPa) rispetto ai virus non ineveloped (GPa). Le particolari immagini del vv a virione singolo sono state ottenute in modalità di maschiatura in condizioni ambientali con un rigido sbalzino. Lo scopo è stato quello di deformare il virus al punto che la densità proteica extra all'interno del virus diventa visibile come un urto all'interno dell'immagine AFM. Questo metodo viene utilizzato per rilevare la densità proteica extra all'interno della cavità del virus19.
Imaging a super risoluzione virione singola:
Gli anticorpi VSV-G etichettati Alexa 647 sono stati usati per rivestire l'involucro dei singoli virioni VSV per esperimenti di super-risoluzione utilizzando il metodo 5A. Per dimostrare la densità di tethering e la bassa associazione aspecifica, nella figura 2Aviene illustrata una scansione di grandi dimensioni del campione. Il recupero della busta virale su un virione rappresentativo è mostrato nella figura 2B (isosuperficie blu).
<img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig1.jpg" style="opacity: 0.9; font-size: 14.399999618530273px; line-height: 28px;">
Figura 1. Imaging AFM di perline e VSV sulla superficie PEGG funzionalizzata. Scansione AFM di perline biotinilate a 36 nm (A, B) e un virione VSV (C) ancorato alla superficie con un anticorpo VSVG biotinilato. AFM è stato fatto in modalità di scansione topografica dell'aria CA. Il raggio della punta è < 25 nm e le misurazioni sono state effettuate sotto modulazione di forza e maschiatura della luce. La punta aveva una costante di forza di 3 N/m e una frequenza risonante di 75 kHz con incertezza di 15 kHz. Mentre le perline hanno mantenuto la loro altezza durante la scansione AFM, il virion VSV ha un modulo giovane significativamente più piccolo ed è significativamente deformato in altezza. In questa immagine il virione è stato specificamente immaginato con un cantilever rigido in modalità di maschiatura che ha prodotto una piccola convoluzione xy (utilizzata per determinare la punta rispetto all'estremità smussata del virus) e la differenza di altezza tra la punta e l'estremità smussata del virus viene utilizzata per rilevare una densità proteica extra all'estremità smussata del virus19.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51366/51366fig2.jpg"> Figura 2. Imaging basato sulla fluorescenza dei virioni VSV sulla superficie funzionalizzata PEGG. A)virioni VSV ricombinanti immobilizzati sulla superficie PEGG utilizzando un anticorpo anti VSVG biotinilato imageizzato in fluorescenza a campo largo. B) Ricostruzione a fluorescenza ad alta risoluzione dell'involucro di VSV attaccato alla superficie PEGG attraverso un anticorpo anti VSVG biotinilato e decorato con anticorpi anti-VSVG etichettati Alexa 647 (il metodo 5A è stato utilizzato per creare queste immagini). La superficie blu è una proiezione isosuperficie 2D. A sinistra mostra un modello del virus a forma di proiettile. 
<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="212"><colgroup>
<col>
<col>
</colgroup>
<tbody>
<tr height="27">
<td height="27" style="height:27px;width:119px;">Dimensioni delle copertine</td>
			<td style="width:93px;">fluido</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">40 mm</td>
			<td>65 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">35 mm</td>
			<td>50 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">30 mm</td>
			<td>36 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">25 mm</td>
			<td>25 μl</td>
		</tr>
<tr height="20">
<td height="20" style="height:20px;">20 mm</td>
			<td>16 μl</td>
		</tr>
</tbody></table>La tabella 1. Aliquote fluide in base alle dimensioni delle copertine.

L'attacco dei virioni a una superficie è un requisito per l'imaging a virione singolo mediante imaging a fluorescenza a super risoluzione o microscopia a forza atomica (AFM). Qui dimostriamo un metodo di preparazione del campione per l'adesione controllata di virioni a superfici di vetro adatte all'uso nell'AFM e nell'imaging a fluorescenza a super risoluzione.

Preparazione del campione per microscopia a forza atomica Virion singola e imaging a fluorescenza a super risoluzione

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Questa procedura prepara coprioggetti in vetro con virus per l'uso in microscopia a forza atomica e microscopia a super risoluzione, come la microscopia fluorescente attivata da fotoni con localizzazione. Per prima cosa, pulire il substrato di vetro e ricoprire il vetro con un sottile film di polietilene glicole parzialmente biotinilato innestato su poli-L-lisina. Successivamente, trattare la superficie con avidina per aumentare l'affinità di legame del film biotinilato.Ora trattare la superficie con anticorpi biotinilati specifici per il virus di interesse. Successivamente, trattare la superficie preparata con anticorpi con il virus di interesse. A differenza della tecnica di spin coating, questo metodo presenta il vantaggio di distribuire in modo omogeneo le varianti lungo la superficie.Per ottimizzare la microscopia, posizionare i coprioggetti verticalmente in un porta-coprioggetti in teflon di dimensioni adeguate e immergerli in un becher riempito con alcol etilico filtrato, sottoponendoli a sonicazione per 30 minuti. Successivamente, lavare accuratamente i coprioggetti con acqua ultrapura. Quindi, posizionare i coprioggetti in un altro porta-coprioggetti in teflon pulito e in un becher riempito con idrossido di sodio uno molare, sottoponendoli nuovamente a sonicazione per 30 minuti, e risciacquare abbondantemente con acqua ultrapura.Ora asciugare le lamelle risciacquate sotto un flusso di azoto e trasferirle in un portalamelle in teflon pulito e asciutto. Verificare che ogni lamella sia priva di pellicole o particelle visibili. Immediatamente dopo l'essiccazione orizzontale sotto flusso di azoto, posizionare una lamella in una piastra di Petri sterile e al centro della lamella aggiungere con una pipetta la quantità appropriata di polilisina biotinilata grafted polietilene glicole in PBS.Posizionare un altro coprioggetto pulito sopra il liquido con il metodo a sandwich. Assicurarsi che il volume compreso tra le superfici attive dei due coprioggetti sia completamente riempito di liquido. Coprire la piastra di Petri e incubare a temperatura ambiente per 45-60 minuti.Successivamente, prendere il sandwich con una pinzetta senza schiacciare il liquido in eccesso. Ora, utilizzando pollice e indice, pinzare leggermente e in senso orizzontale il sandwich. Far scivolare le coprioggetti in direzioni opposte e separarle senza toccare le facce attive.Risciacquare entrambe le facce attive con 25 millilitri di acqua ultrapura. Asciugare ora le coprioggetti con un flusso di azoto e annotare quali facce delle coprioggetti sono attive, quindi posizionarle in una piastra di Petri sterile. Posizionare una coprioggetti trattata con la faccia attiva rivolta verso l'alto e aggiungere con una pipetta una quantità appropriata di soluzione scongelata al centro della faccia attiva.Posizionare un altro coprioggetto con la faccia attiva rivolta verso il basso per sigillare il liquido, quindi incubare a temperatura ambiente per 25-30 minuti. Successivamente, separare i due coprioggetti come mostrato in precedenza, avendo cura di non toccare le facce attive.Ora risciacquare entrambe le facce attive con 25 millilitri di acqua ultrapura e quindi asciugare le lamelle con un flusso di azoto. È importante ricordare quali facce delle lamelle sono attive. A scopo di riferimento futuro, posizionare immediatamente una lamella attivata e trattata con la faccia attiva rivolta verso l'alto in una piastra di Petri sterile, quindi aggiungere con una pipetta una quantità appropriata di anticorpo biotinilato scongelato al centro della faccia attiva.Posizionare un altro cover slip con la faccia attiva rivolta verso il basso sul liquido con il metodo a sandwich. Quindi incubare a temperatura ambiente per 45-60 minuti. Dopo aver separato i due cover slip, risciacquare entrambe le facce attive con 25 millilitri di PBS. Successivamente, posizionare un cover slip trattato con anticorpo con la faccia attiva rivolta verso l'alto in una piastra di Petri sterile ed aggiungere con la pipetta una quantità appropriata di virus al centro della faccia attiva.Ora effettuare un'aggiunta di un secondo coperchio attivo, inserire un coverglass e incubare. Successivamente, separare i due coverglass. Lavare entrambe le superfici attive con 25 millilitri di PBS e trasferirli in una griglia in teflon e un becher riempiti di PBS.Utilizzare immediatamente i campioni preparati oppure conservarli a quattro gradi Celsius per un massimo di tre giorni. Qui, la variante di tipo selvaggio del virus della stomatite vescicolare è stata ancorata alla superficie di vetro ed analizzata mediante microscopia a forza atomica. La larghezza e la lunghezza del virione sono di 80 nanometri per 180 nanometri, mostrando minime distorsioni rispetto alle dimensioni originali del virione.In questo esperimento, il singolo virione è stato immaginato mediante microscopia fluorescente a localizzazione con attivazione fotoinducibile. Utilizzando anticorpi VSVG marcati con Alexis 647. L'is superficie blu mostra la superficie ricostruita del virione ottenuta mediante microscopia FOM.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare coprioggetti di vetro con virus per l'uso con microscopia a forza atomica o microscopia a super risoluzione. È importante ricordare in ogni momento quale faccia del coprioggetto presenta la chimica attiva.

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Genomica singolo virus (SVG) è un metodo per isolare e amplificare il genoma di singoli virons. Sospensioni virali di un assemblaggio misto sono ordinati mediante citometria a flusso su un vetrino da microscopio con pozzi discrete contenenti agarosio, catturando così il virione e la riduzione del genoma taglio durante la lavorazione a valle. Intero genoma amplificazione viene ottenuta utilizzando multipla di amplificazione dello spostamento (MDA) risultante in materiale genomico che è adatto...

Isolamento e analisi del genoma di virioni singole utilizzando &quot;Genomica singolo virus &#39;

Fonte: Zeigler Allen, L., et al. Isolamento e Analisi del Genoma di Singoli Virioni mediante 'Genomica del Singolo Virione' J. Vis. Exp. (2013).Questo video dimostra come la citometria a flusso permetta l'isolamento di singoli virus contenenti genoma da popolazioni miste mediante rilevamento basato sulla fluorescenza e un ordinamento preciso delle particelle, seguito da inclusione in agarosio per la successiva caratterizzazione genomica.

Smistamento basato sulla fluorescenza di singole particelle virali per l'analisi genomica

Questo manoscritto utilizza l'open-source pacchetto software VirusMapper Fiji-based per applicare l'analisi singola particella di immagini di microscopia super-risoluzione al fine di generare modelli precisi di struttura nanoscala.

Analisi singola particella open-source per Super-risoluzione Microscopia con VirusMapper

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per ottenere risultati di localizzazione sottocellulare della proteina sulla retina di zebrafish correlando microscopia di Super-risoluzione e immagini di microscopia elettronica di scansione.

Microscopia elettronica e correlativo super-risoluzione per risolvere la localizzazione della proteina nella Retina di Zebrafish

Qui presentiamo un protocollo per la combinazione di due tecniche di elaborazione del campione, ad alta pressione congelamento e trattamento dei campioni assistita da microonde, seguita da minima resina incorporamento per l'acquisizione di dati con un microscopio elettronico a scansione di fascio ionico focalizzato (FIB-SEM). Questo è dimostrato utilizzando un mouse del nervo tibial campione e Caenorhabditis elegans.

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

Qui, descriviamo un metodo di microaspirazione a singola cellula per la separazione delle amebe infette. Al fine di separare le sottopopolazioni virali in Vermamoeba vermiformis infettate da Faustovirus e virus giganti sconosciuti, abbiamo sviluppato il protocollo descritto di seguito e dimostrato la sua capacità di separare due nuovi virus giganti a bassa abbondanza.

Micro-aspirazione a cella singola come strategia alternativa per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza per la separazione delle miscele di virus giganti

Qui, presentiamo una pipeline per la fresatura di fasci ionici focalizzati correlativi 3D sulla guida della preparazione di campioni cellulari per la tomografia crioelettronica. La posizione 3D delle proteine di interesse marcate con fluorescenza viene prima determinata mediante microscopia a criofluorescenza e quindi mirata per la fresatura. Il protocollo è adatto per cellule di mammiferi, lieviti e batteri.

Preparazione del campione mediante fresatura a fascio ionico focalizzato correlativo 3D per la tomografia crioelettronica ad alta risoluzione

Qui vengono descritti i protocolli per preparare assemblaggi di virus adatti per l'analisi liquido-EM e crio-EM su scala nanometrica utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione.

Miglioramento dell'imaging ad alta risoluzione di assemblaggi di virus in liquidi e ghiaccio

Questo protocollo video illustra come eseguire la tomografia al microscopio elettronico a scansione a trasmissione di campioni virologici. Per ottenere risultati ottimali, i campioni vengono preparati mediante congelamento ad alta pressione e successiva sostituzione con congelamento.

Tomografia al microscopio elettronico a scansione a trasmissione in virologia: imaging 3D di campioni congelati ad alta pressione, liofilizzati

Questo protocollo dettaglia le applicazioni avanzate di imaging e la gestione delle risorse condivise di un sistema di microscopio confocale a scansione laser integrato con un rivelatore a matrice multiplexata per imaging cellulare e subcellulare ad alta risoluzione. Il flusso di lavoro consente imaging multimodale da confocale a super-risoluzione (~120 nm) all'interno di un'unica piattaforma, rendendo la visualizzazione su scala nanometrica più accessibile.

Imaging a superrisoluzione e gestione condivisa: un protocollo per la microscopia confocale con rilevamento multiplex

Impara a preparare vetrini con virioni per microscopia a forza atomica e imaging a super risoluzione. Questo metodo garantisce adesione controllata per analisi strutturali ad alta risoluzione del virus della stomatite vescicolare.

Preparazione del campione per microscopia a forza atomica Virion singola e imaging a fluorescenza a super risoluzione

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