Preparazione del campione per microscopia a forza atomica Virion singola e imaging a fluorescenza a super risoluzione

Questa procedura prepara vetrini coprivetri con virus per l'uso nella microscopia a forza atomica e nella microscopia a super risoluzione, come la microscopia di localizzazione fotoattivata fluorescente. Innanzitutto, pulire il substrato di vetro, rivestire il vetro con un sottile film di polietilenglicole parzialmente biotinilato innestato a poli L lisina. Successivamente, trattare la superficie con avadon per aumentare l'affinità di legame del film biotinilato.

Ora tratta la superficie con anticorpi biotinilati specifici per il virus di interesse. Quindi trattare la superficie preparata con l'anticorpo con il virus di interesse. A differenza dello spin coating, questa tecnica ha il vantaggio di distribuire le varianti lungo la superficie in modo omogeneo.

Per ottimizzare la microscopia, posizionare i vetrini coprioggetto verticalmente in una rastrelliera in teflon di dimensioni adeguate e immergerli in un becher riempito con alcol etilico filtrato sonicato per 30 minuti. Quindi sciacquare accuratamente i vetrini coprioggetto con acqua ultra pura. Successivamente, posizionare i vetrini di copertura in una griglia di teflon pulita separata e in un becher riempito con un molare di idrossido di sodio sonicato per 30 minuti e risciacquare abbondantemente con acqua ultrapura.

Ora asciugare i vetrini di copertura risciacquati sotto un flusso di azoto e trasferirli su una griglia di teflon pulita e asciutta. Verificare che ogni vetrino coprioggetto sia pulito da pellicole o particelle visibili. Immediatamente dopo l'essiccazione nel flusso di azoto orizzontalmente, posizionare un vetrino coprioggetto in una capsula di Petri sterile al centro del vetrino coprioggetti per pipettare la quantità appropriata di polietilenglicole biotinilato innestato con polilisina in PBS.

Posizionare un altro vetrino coprioggetti pulito sopra il fluido in un metodo a sandwich. Assicurarsi che il volume tra le facce attive dei due vetrini coprioggetti sia completamente riempito di liquido. Coprire la capsula di Petri e incubare a temperatura ambiente per 45-60 minuti.

Quindi, raccogli il panino con un paio di pinzette senza pizzicare il liquido in eccesso. Ora usando il pollice e l'indice, pizzicare leggermente e orizzontalmente il panino. Far scorrere i vetrini coprioggetto in direzioni opposte e separarli senza toccare le facce attive.

Sciacquare entrambi i visi attivi con 25 millilitri di acqua ultra pura. Asciugare ora i vetrini coprioggetti con un getto di azoto e annotare quali facce dei vetrini coprioggetti sono attive in una piastra di Petri sterile. Posizionare un vetrino coprioggetti trattato con la pipetta attiva rivolta verso l'alto una quantità appropriata di soluzione di evidenza scongelata al centro della faccia attiva.

Posizionare un altro vetrino coprioggetti con la faccia attiva rivolta verso il basso per inserire il fluido, quindi incubare a temperatura ambiente per 25-30 minuti. Quindi, separare i due vetrini coprioggetto come mostrato in precedenza. Facendo attenzione a non toccare i volti attivi.

Ora sciacquare entrambe le facce attive con 25 millilitri di acqua ultra pura e poi asciugare i vetrini coprioggetti con un getto di azoto. È importante ricordare quali facce del vetrino coprioggetto sono attive. Per riferimento futuro, posizionare immediatamente un vetrino coprioggetto attivo a faccia in su in una capsula di Petri sterile, pipettare una quantità appropriata di anticorpo biotinilato scongelato al centro del viso attivo.

Posizionare un altro vetrino coprioggetti con la faccia attiva rivolta verso il basso sopra il fluido in un metodo a sandwich. Quindi incubare a temperatura ambiente per 45-60 minuti Dopo aver separato i due vetrini, sciacquare entrambe le facce attive con 25 millilitri di PBS. Quindi posizionare un vetrino coprioggetti trattato con anticorpi con il lato attivo rivolto verso l'alto in una piastra di Petri sterile e pipettare una quantità appropriata di virus al centro del viso attivo.

Ora inserire un sandwich con un secondo coperchio attivo, scivolare, coprire e incubare. Ora separare i due vetrini coprioggetto. Sciacquare entrambe le facce attive con 25 millilitri di PBS e trasferirle su una rastrelliera e un bicchiere di teflon riempito di PBS.

Utilizzare immediatamente i campioni preparati o conservarli a quattro gradi Celsius per un massimo di tre giorni. Qui. Le variazioni wild type del virus della stomatite vescicolare sono state ancorate alla superficie del vetro e analizzate mediante microscopia a forza atomica. La larghezza e la lunghezza del virione sono di 80 nanometri per 180 nanometri, mostrando distorsioni minime rispetto alle dimensioni originali del virione.

In questo esperimento, il singolo virione è stato ripreso mediante microscopia fluorescente di localizzazione di fotoattivazione. Utilizzo di anticorpi VSVG marcati con Alexis 6 47. L'isosuperficie blu mostra la superficie recuperata del virione utilizzando la microscopia FOM.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i vetrini coprioggetto con virus per l'uso con la microscopia a forza atomica o la microscopia a super risoluzione. È importante ricordare in ogni momento su quale faccia del vetrino coprioggetto è presente la sostanza chimica attiva.