Generazione di giunzioni neuromuscolari utilizzando un dispositivo microfluidico

Inizia con un dispositivo microfluidico rivestito di polimero dotato di pozzetti interconnessi che trasportano compartimenti a specchio collegati tramite microscanalature.

Semina le cellule progenitrici neurali nei pozzetti di un compartimento.

Consenti loro di migrare nel canale interconnesso e aderire al polimero.

Sovrapporre con un mezzo di crescita per promuovere la maturazione neuronale nei motoneuroni.

Nel compartimento opposto, seminare i pozzetti con le cellule progenitrici muscolari, che migrano e aderiscono al canale interconnesso.

Sostituire il terreno con un mezzo di differenziazione, inducendo la fusione delle cellule progenitrici muscolari e formando cellule muscolari multinucleate.

Aggiungere un terreno di differenziazione neuronale contenente fattori di crescita al compartimento contenente le cellule muscolari.

Nel frattempo, aggiungere mezzo volume di terreno privo di fattore di crescita al compartimento contenente le cellule neurali.

I fattori di crescita e un volume più elevato di terreno nel compartimento opposto favoriscono i motoneuroni ad estendere i loro processi attraverso i microsolchi.

Questi processi neuronali si connettono quindi con le cellule muscolari, formando giunzioni neuromuscolari.

Per placcare le cellule progenitrici neurali, o NPC, nel dispositivo microfluidico, rimuovere la DPBS da due pozzetti su un lato delle microscanalature nel dispositivo utilizzando una pipetta da 200 microlitri. Per seminare un totale di 250.000 NPC in 60-100 microlitri di terreno motoneuronale al giorno 10 per dispositivo nel pozzetto in alto a destra, seminare metà della sospensione cellulare vicino all'apertura del canale con un angolo di 45 gradi.

Fate una pausa di alcuni secondi per consentire alla sospensione cellulare di fluire attraverso il canale prima di aggiungere la metà rimanente della sospensione cellulare nel pozzetto inferiore. Utilizzare una penna per contrassegnare il lato seminato come NPC o equivalente per un facile orientamento del dispositivo senza microscopio e incubare per cinque minuti per l'attacco delle cellule. Quindi, rabboccare lentamente i due pozzetti seminati con NPC con un ulteriore mezzo di motoneurone al giorno 10 fino a un volume totale di 200 microlitri per pozzetto. Utilizzando una pipetta da 200 microlitri, rimuovere il DPBS dai due pozzetti sull'altro lato dei microsolchi opposti agli NPC appena seminati.

Aggiungere 200 microlitri di mezzi di motoneurone del giorno 10 per pozzetto ai pozzetti non seminati. Quindi, aggiungere 6 millilitri di DPBS per piatto da 10 centimetri attorno al dispositivo per evitare l'evaporazione del terreno durante l'incubazione.

Per cambiare il terreno, rimuovere lentamente il terreno in entrambi i pozzetti con NPC posizionando la punta della pipetta da 200 microlitri sul bordo inferiore della parete del pozzetto di fronte all'apertura del canale. Per evitare che un forte flusso di fluido danneggi le cellule nel canale, aggiungere lentamente da 50 a 100 microlitri di terreno fresco per motoneuroni in ciascun pozzetto, passando continuamente tra il pozzetto superiore e quello inferiore. Ripetere il processo fino a quando ogni pozzetto contiene 200 microlitri di terreno.

Il 17° giorno della differenziazione del motoneurone, rimuovere il mezzo del motoneurone sul lato non seminato delle microscanalature nel dispositivo con una pipetta da 200 microlitri e lavare i pozzetti con DPBS. Semina un totale di 200.000 mesoangioblasti primari umani o MAB in 60-100 microlitri di terreno di crescita per dispositivo, seminando metà della sospensione cellulare nel pozzetto superiore.

Mettere in pausa per alcuni secondi per consentire alla sospensione cellulare di fluire attraverso il canale prima di seminare la metà rimanente della sospensione cellulare nel pozzetto inferiore, come dimostrato in precedenza per la placcatura degli NPC. Incubare il dispositivo per cinque minuti per l'attacco delle cellule. Quindi, rabboccare i due pozzetti appena seminati con MAB con un ulteriore terreno di coltura e incubare nuovamente come dimostrato.

Per avviare il gradiente chemiotattico e volumetrico il 21° giorno della differenziazione del motoneurone, aggiungere 200 microlitri per pozzetto di terreno basale del motoneurone contenente fattori di crescita al compartimento del miotubo. Quindi, aggiungere 100 microlitri per pozzetto di terreno basale del motoneurone senza fattori di crescita al compartimento del motoneurone.