Valutazione di una giunzione neuromuscolare funzionale tramite stimolazione ottica simultanea e registrazione video

Inizia con un bioreattore con una camera muscolare contenente tessuto muscolare incorporato nel collagene supportato dai pilastri della camera.

Il canale della neurosfera contiene una neurosfera in una matrice di collagene. I motoneuroni della neurosfera esprimono canali sensibili alla luce.

Aggiungi un mezzo di differenziazione contenente fattori di crescita neurali che stimolano i neuroni a estendere le loro proiezioni.

Scambiare regolarmente il mezzo per garantire un'estensione continua dei neuroni verso il tessuto muscolare, formando giunzioni neuromuscolari.

Osservare il bioreattore al microscopio dotato di una fotocamera e di una sorgente di luce blu.

Applicare impulsi di luce blu per aprire i canali sensibili alla luce nei neuroni, consentendo agli ioni del mezzo di fluire e stimolare i neuroni a generare segnali elettrici.

Questi segnali viaggiano attraverso le proiezioni neuronali fino alle giunzioni neuromuscolari, trasmettendo il segnale elettrico al tessuto muscolare.

Registra un video contemporaneamente. Una graduale contrazione della fibra muscolare conferma lo sviluppo di una giunzione neuromuscolare funzionale.

Preparare una miscela 4 a 1 di 3 milligrammi per millilitro di collagene I e matrice solubilizzata della membrana basale. Quindi, risospendere i mioblasti in questa miscela di collagene appena preparata.

Quindi, aggiungere 15 microlitri di questa sospensione di collagene cellulare a ciascuna camera muscolare del bioreattore, assicurandosi di distribuire la sospensione su entrambi i pilastri utilizzando la punta della pipetta. Lasciare polimerizzare la miscela di gel cellulare a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi, riempire ogni pozzetto del bioreattore con 450 microlitri di terreno di coltura miotonico.

L'undicesimo giorno di differenziazione dei motoneuroni, trasferire le cellule e i mezzi in un tubo da 50 millilitri e lasciare che le neurosfere si depositino sul fondo per 5 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 15 millilitri di terreno di coltura in sospensione per motoneuroni integrato con 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dal cervello e 10 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dalle cellule gliali.

Il giorno 14 dei protocolli di differenziazione, seminare i motoneuroni nella piattaforma. Preparare una miscela di gel 4 a 1 di 2 milligrammi per millilitro di collagene I e matrice di membrana basale solubilizzata. Utilizzare un colino cellulare a 400 nanometri per selezionare grandi neurosfere e risospenderle nella miscela di gel preparata.

Aspirare con cautela il terreno dal serbatoio e dal pozzetto della neurosfera. Quindi, aggiungere 15 microlitri della miscela di gel nel canale della neurosfera. Caricare una pipetta da 10 microlitri con 10 microlitri di gel e prelevare una neurosfera. Depositare la neurosfera nel canale della neurosfera, assicurandosi che si trovi nella camera. Quindi, sollevare lentamente la pipetta rilasciando il gel rimanente una volta depositata la neurosfera.

Lasciare polimerizzare il gel per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Quindi, aggiungere 450 microlitri di NbActiv4 integrati con 20 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dal cervello e 10 nanogrammi per millilitro di fattore neurotrofico derivato dalle cellule gliali.

Per l'imaging, utilizzare un microscopio a fluorescenza invertita con un software scientifico complementare per fotocamera a semiconduttore di ossido di metallo. Imposta il binning su 2x2, l'esposizione a 20 millisecondi, l'otturatore lineare attivato, la velocità di lettura a 540 megahertz, la gamma dinamica a 12 bit e guadagno 1 e la modalità sensore su sovrapposizione. Utilizzare un obiettivo 2x sul microscopio per visualizzare i microtessuti e collegare una camera di cellule vive al tavolino del microscopio.

Selezionare la regione di interesse che contiene i tessuti scheletrici innervati per ridurre al minimo le dimensioni del file e il tempo di elaborazione. Quindi, posizionare un filtro di emissione passa-lungo da 594 nanometri tra il campione e l'obiettivo di imaging per filtrare gli impulsi di luce blu dalla fotocamera. Quindi, posizionare una piastra rettangolare a quattro pozzetti contenente quattro bioreattori nella camera cellulare viva. Quindi, fai clic su Live View e centra e metti a fuoco l'immagine con il ROI desiderato.

Scarica il macrocodice personalizzato dalla cartella GitHub per controllare la posizione del palco, la scheda Arduino e l'acquisizione video. Quindi, imposta il filmato di output come day_tissuegroup_tissuename_experiment. ND2. Esegui il macrocodice con le coordinate x e y desiderate impostate sul palco e acquisisci un rapido time-lapse con 1.700 fotogrammi a 50 fotogrammi al secondo.

Dopo l'imaging, sostituire il terreno e rimettere i campioni nell'incubatore. Attendere almeno 24 ore tra le sessioni di acquisizione delle immagini per evitare l'affaticamento dei tessuti.