Utilizzando un dispositivo di microfluidica per stimolazione meccanica e alta risoluzione Imaging di c. elegans

L'obiettivo generale di questa tecnica è misurare il modo in cui i nematodi e i loro neuroni rispondono a stimoli meccanici esterni utilizzando una configurazione di chip microfluidico con attuatori di pressione. Questo metodo può rispondere a domande chiave nei campi della meccanobiologia e della biologia sensoriale, come ad esempio il modo in cui le cellule, i tessuti e gli animali rispondono alla stimolazione meccanica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che riduce sufficientemente la mobilità del verme in modo non invasivo da consentire l'imaging ad alta risoluzione pur avendo accesso alla cuticola del verme per la stimolazione meccanica.

Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare l'influenza dei segnali meccanici sullo sviluppo. Potrebbe anche essere applicato ad altri sistemi come l'esposizione di organi ex vivo o altri animali di dimensioni simili a C.Elegans. Configura un sistema di microscopio per l'eccitazione simultanea di GCaMP e RFP.

Un'opzione è una fonte di luce discreta che trasmette solo luce ciano e gialla. Per la visualizzazione, utilizzare un obiettivo 10x e un obiettivo ad alto ingrandimento. Inoltre, invia l'immagine a un computer tramite fotocamera digitale.

Successivamente, includi un cubo di florescenza e, se necessario, un filtro di eccitazione. Aggiungi al cubo uno specchio dicroico che riflette la luce ciano e gialla e trasmette la luce verde e rossa. Installare un divisore di fascio con uno specchio dicroico a passaggio lungo con un cutoff a 570 nanometri.

Inoltre, fornire un filtro di emissione passa-banda per la luce verde a 525 nanometri con una larghezza di 50 nanometri e un filtro di emissione passa-banda per la luce rossa a 632 nanometri con una larghezza di 60 nanometri. Proietta entrambi i raggi nel campo visivo della telecamera. Assicurati che la parte verde sia proiettata nella metà superiore dello schermo e la parte rossa nella parte inferiore.

Utilizzare sempre chip microfluidici che abbiano meno di un mese. Per la configurazione, caricare prima il serbatoio del flusso a gravità con M9 filtrato. Posizionare il serbatoio a circa 60 centimetri sopra il chip e collegarlo a un'uscita del chip. Quindi, collegare l'altra uscita a un contenitore dei rifiuti con due ingressi e collegare il secondo ingresso al contenitore dei rifiuti a una pompa peristaltica.

Effettuare tutti i collegamenti con tubi in polietilene. Quindi, assemblare le interconnessioni, lunghezze di tubo di 50 millimetri con connettori per tubi metallici su entrambe le estremità. Inserire a pressione e collegare l'unità su ciascuna delle sei dita di azionamento e nell'ingresso della vite senza fine.

Ora, posiziona il chip sotto l'ottica. Assicurati di lasciare le interconnessioni attaccate al chip poiché il PDMS si consumerà rapidamente con manipolazioni ripetute. È fondamentale che l'attuatore PDMS e il tubo che collega il chip al serbatoio dell'aria siano adeguatamente sigillati per garantire una buona attuazione cromatica del diaframma.

Prima di caricare gli animali, verificare la perdita di pressione nel chip microfluidico. Misurare la deflessione della membrana eseguendo diversi cicli di attuazione alla pressione desiderata. Quindi, confronta i valori quantitativi con le previsioni teoriche.

Se i valori misurati non sono quelli previsti, verificare la presenza di perdite nel tubo o nei connettori del tubo. Il PDMS può anche avere una diversa elasticità a causa di un rapporto alternativo tra polimero di base e agente indurente, oppure la massa del PD potrebbe essere vecchia ed eccessivamente reticolata. Hanno preparato C.elegans sincronizzati per l'età con i giovani adulti o per gli adulti del primo giorno, come descritto da Porta-de-la-Riva e compagnia nella loro pubblicazione Jove del 2012.

Ora, scegli da due a cinque giovani adulti o ermafroditi di un giorno. La scelta di animali della taglia corretta è fondamentale. Gli animali di piccola taglia non rimarranno intrappolati nel canale e gli animali troppo grandi saranno difficili da rimuovere e possono intasare il dispositivo.

Tirare i vermi raccolti in una goccia di M9 filtrato. Quindi, aspirarli in un tratto di tubo utilizzando una siringa da un millilitro senza tirarli nel corpo della siringa stessa. Quindi, collegare il tubo all'interconnessione all'ingresso della vite senza fine del chip. Quindi, attivare il flusso per gravità aprendo la valvola del serbatoio e avviando la pompa.

Ora, osserva il canale di cattura con un ingrandimento quattro volte e spingi delicatamente gli animali nel dispositivo. Dopo aver caricato gli animali nella camera di attesa, utilizzare lo stantuffo per far scorrere delicatamente uno di essi verso la parte anteriore del canale di cattura in modo che la sua testa entri nella forma affusolata del canale. Se il verme non riempie l'intera sezione trasversale del canale dal naso fino a quasi l'estremità del corpo, rimuovere il verme.

Molte volte, i vermi troppo piccoli passeranno direttamente attraverso il chip senza essere intrappolati. Se un animale che è rimasto intrappolato nel canale di intrappolamento deve essere rimosso, è sufficiente premere lo stantuffo della siringa fino a quando il verme non scompare dal canale e quindi caricare un nuovo verme. Una volta che un verme è caricato correttamente, passa alla modalità di fioritura e aumenta l'ingrandimento.

Per evitare la saturazione, assicurarsi di regolare l'intensità di eccitazione in base all'intensità della fioritura. Controlla se il neurite di un neurone di interesse si trova attraverso il diaframma di uno degli attuatori. Quell'attuatore deve anche essere anteriore al corpo cellulare del neurone.

In caso contrario, regolare la posizione dell'animale tirando o spingendo lo stantuffo. Se ciò non aiuta, rimuovi il worm e caricane uno nuovo. Inoltre, se ci sarà autofluorescenza intorno al neurone, sostituire il verme.

Una volta che un verme è caricato correttamente, concentrati sul corpo cellulare del neurone di interesse, quindi determina quale attuatore si trova il chip sul lato anteriore e collega questo attuatore alla pompa a pressione programmabile utilizzando l'interconnessione associata. Se l'esperimento richiede la misurazione della distanza tra l'attuatore e il neurone, inserire entrambi nel campo visivo con la parete del canale parallela al bordo superiore e inferiore dell'immagine. Quindi, definire un protocollo di pressione utilizzando la pompa a pressione programmabile.

Inizia sempre scattando almeno 50 immagini a zero kilopascal per definire una linea di base. Quindi, programmare la forma d'onda e la pressione dello stimolo. A questo punto, eseguire il protocollo di imaging e pressione.

Durante la registrazione, il neurone di interesse deve essere il punto più luminoso in un'area di 10 pixel quadrati. Non può spostarsi di più di 10 pixel in due immagini sequenziali e deve rimanere nel campo visivo. Durante la registrazione, è possibile osservare variazioni nell'intensità della florescenza quando la pressione e gli attuatori cambiano.

Ciò indica una stimolazione riuscita dei neuroni. Tra uno stimolo e l'altro, includere 10 secondi a una pressione costante di zero kilopascal. È possibile registrare contemporaneamente segnali da più neuroni nel campo visivo, purché siano separati da almeno 10 pixel durante l'intera registrazione.

Per conservare i vermi per ulteriori studi, scollegare le uscite del chip verso il flusso di gravità e il contenitore dei rifiuti. Quindi, premere delicatamente lo stantuffo fino a quando l'intero verme non viene spinto attraverso il canale di intrappolamento nel canale di flusso e continuare a premere lo stantuffo fino a quando l'animale appare in una gocciolina all'esterno del chip. Ora, scollegare la siringa con il tubo e aspirare il verme nella gocciolina su una piastra di agar.

Per rimuovere e sacrificare un verme nel canale, premere lo stantuffo fino a quando l'intero verme non viene spinto attraverso il canale di intrappolamento e nel canale di flusso. Quindi, il verme uscirà dal truciolo e finirà nel contenitore dei rifiuti. Dopo aver impostato il chip microfluidico, è stata testata la deflessione del diaframma.

I valori misurati erano riproducibili con lievi variazioni non superiori a un micron a 450 kilopascal di pressione. Dopo aver inserito le viti all'interno dell'ingresso del truciolo, la pelle di un singolo animale all'interno del canale di cattura è stata presentata ai sei attuatori. Con questo design, il neurone PLM di solito non può essere immobilizzato completamente, quindi è libero di muoversi lateralmente e verticalmente.

Sebbene sia possibile attivare con successo i neuroni PLM, la registrazione dei transienti di calcio da essi è difficile a causa del movimento della coda. Una volta in posizione, l'animale è stato stimolato utilizzando uno dei sei attuatori posizionati per fornire stimoli meccanici a ciascuno dei sei TRN. È stato presentato uno dei tre diversi stimoli di due secondi.

Una presa a 275 kilopascal, una rampa a 275 kilopascal o un ronzio consistente in un seno da 75 kilopascal a 10 hertz sovrapposto al passo da 275 kilopascal. Intervalli di 10 secondi senza pressione separavano gli stimoli. Le rampe di pressione e i gradini di pressione attivavano i TRN solo se gli stimoli raggiungevano pressioni superiori a 400 kilopascal, mentre gli stimoli di ronzio attivavano robustamente tutti i TRN.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita entro cinque minuti per verme. È importante ricordare che una scarsa tenuta tra il chip e il vetrino coprioggetti, o tra il chip e gli interconnettori, causerà perdite e guasti al dispositivo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'imaging del voltaggio o la somministrazione mirata di stimoli meccanici a diversi neuroni per caratterizzare la risposta meccanica dei nocicettori.

Inoltre, poiché gli animali possono essere recuperati seguendo questa procedura, la tecnica potrebbe essere utilizzata per lo screening di mutanti difettosi nella loro risposta agli stimoli meccanici. Non dimenticare che lavorare con gas compressi e sostanze chimiche può essere estremamente pericoloso. Prendere precauzioni come indossare indumenti protettivi individuali e lavorare in cappe aspiranti quando necessario per evitare tali pericoli.