Name: Utilizzando un dispositivo di microfluidica per stimolazione meccanica e alta risoluzione Imaging di c. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Scopri la stimolazione meccanica selettiva di nematodi immobilizzati tramite microfluidica per l'imaging ad alta risoluzione delle risposte neuronali in C. elegans. Questa tecnica avanza la ricerca in meccanobiologia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ringraziamo Sandra N. Manosalvas-Kjono, Ladpli di Purim, Farah Memon, Divya Gopisetty e Veronica Sanchez per supporto nella progettazione del dispositivo e della generazione di animali mutanti. Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni NIH R01EB006745 (di BLP), R01NS092099 (di MBG), K99NS089942 (per MK), F31NS100318 (per ALN) e ha ricevuto finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (CER) nell'ambito dell'Unione europea Horizon 2020 ricerca e innovazione programma ( Convenzione n. 715243 di sovvenzione MK).

<ol><li>Eastwood, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+mechanics+govern+the+rapidly+adapting+and+symmetrical+response+to+touch%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Tissue mechanics govern the rapidly adapting and symmetrical response to touch.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 15 (50), E6955-E6963 (2015).</li>
<li>Katta, S., Krieg, M., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeling+Force%3A+Physical+and+Physiological+Principles+Enabling+Sensory+Mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Feeling Force: Physical and Physiological Principles Enabling Sensory Mechanotransduction.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 31, 347-371 (2015).</li>
<li>Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+systems+biology+of+C.+elegans+touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Mechanical systems biology of C. elegans touch sensation.</a> BioEssays. 37 (3), 335-344 (2015).</li>
<li>Krieg, M., Dunn, A. R., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+control+of+the+sense+of+touch+by+%CE%B2-spectrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical control of the sense of touch by β-spectrin.</a> Nat. Cell Biol. 16 (3), 224-233 (2014).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tensile+forces+govern+germ-layer+organization+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tensile forces govern germ-layer organization in zebrafish.</a> Nat Cell Biol. 10 (4), 429-436 (2008).</li>
<li>Gaub, B. M., Müller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+stimulation+of+Piezo1+receptors+depends+on+extracellular+matrix+proteins+and+directionality+of+force%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Mechanical stimulation of Piezo1 receptors depends on extracellular matrix proteins and directionality of force.</a> Nano Lett. 17 (3), 2064-2072 (2017).</li>
<li>Geffeney, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEG%2FENaC+but+not+TRP+channels+are+the+major+mechanoelectrical+transduction+channels+in+a+c.+Elegans+nociceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">DEG/ENaC but not TRP channels are the major mechanoelectrical transduction channels in a c. Elegans nociceptor.</a> Neuron. 71 (5), 845-857 (2011).</li>
<li>O'Hagan, R., Chalfie, M., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MEC-4+DEG%2FENaC+channel+of+Caenorhabditis+elegans+touch+receptor+neurons+transduces+mechanical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The MEC-4 DEG/ENaC channel of Caenorhabditis elegans touch receptor neurons transduces mechanical signals.</a> Nat. Neurosci. 8 (1), 43-50 (2005).</li>
<li>Suzuki, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vivo+Imaging+of+C.+elegans+Mechanosensory+Neurons+Demonstrates+a+Specific+Role+for+the+MEC-4+Channel+in+the+Process+of+Gentle+Touch+Sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In Vivo Imaging of C. elegans Mechanosensory Neurons Demonstrates a Specific Role for the MEC-4 Channel in the Process of Gentle Touch Sensation.</a> Neuron. 39 (6), 1005-1017 (2003).</li>
<li>Kopito, R. B., Levine, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Durable+spatiotemporal+surveillance+of+Caenorhabditis+elegans+response+to+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Durable spatiotemporal surveillance of Caenorhabditis elegans response to environmental cues.</a> Lab Chip. 14 (4), 764-770 (2014).</li>
<li>Chokshi, T. V., Ben-Yakar, A., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CO2+and+compressive+immobilization+of+C.+elegans+on-chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">CO2 and compressive immobilization of C. elegans on-chip.</a> Lab Chip. 9 (1), 151(2009).</li>
<li>Hulme, S. E., Shevkoplyas, S. S., McGuigan, A. P., Apfeld, J., Fontana, W., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan-on-a-chip%3A+microfluidic+chambers+for+performing+lifelong+observation+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Lifespan-on-a-chip: microfluidic chambers for performing lifelong observation of C. elegans.</a> Lab Chip. 10 (5), 589-597 (2010).</li>
<li>Li, S., Stone, H. a, Murphy, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+and+automatic+counting+system+for+the+study+of+C.+elegans+reproductive+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device and automatic counting system for the study of C. elegans reproductive aging.</a> Lab Chip. 15 (2), 524-531 (2015).</li>
<li>Chokshi, T. V., Bazopoulou, D., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+microfluidic+platform+for+calcium+imaging+of+chemosensory+neurons+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">An automated microfluidic platform for calcium imaging of chemosensory neurons in Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 10 (20), 2758-2763 (2010).</li>
<li>Mishra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+microfluidics+chips+for+live+imaging+and+study+of+injury+responses+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Using microfluidics chips for live imaging and study of injury responses in Drosophila larvae.</a> J. Vis. Exp. , e50998(2014).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Krajniak, J., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+high-resolution+imaging+and+culture+of+C.+elegans+in+chip-gel+hybrid+microfluidic+device+for+developmental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Long-term high-resolution imaging and culture of C. elegans in chip-gel hybrid microfluidic device for developmental studies.</a> Lab Chip. 10 (14), 1862-1868 (2010).</li>
<li>Vasquez, V., Krieg, M., Lockhead, D., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+that+Contain+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Enhance+Neuronal+Cell+Mechanics+and+Touch+Sensation%5BTitle%5D)+AND+%22CellReports%22%5BJournal%5D)">Phospholipids that Contain Polyunsaturated Fatty Acids Enhance Neuronal Cell Mechanics and Touch Sensation.</a> CellReports. 6 (1), 70-80 (2013).</li>
<li>Krieg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+defects+in+%CE%B2-spectrin+and+tau+sensitize+C.+elegans+axons+to+movement-induced+damage+via+torque-tension+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Genetic defects in β-spectrin and tau sensitize C. elegans axons to movement-induced damage via torque-tension coupling.</a> Elife. 6 (2010), e20172(2017).</li>
<li>Arnadóttir, J., O'Hagan, R., Chen, Y., Goodman, M. B., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DEG%2FENaC+protein+MEC-10+regulates+the+transduction+channel+complex+in+Caenorhabditis+elegans+touch+receptor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The DEG/ENaC protein MEC-10 regulates the transduction channel complex in Caenorhabditis elegans touch receptor neurons.</a> J. Neurosci. 31 (35), 12695-12704 (2011).</li>
<li>Lockhead, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5170555/">The tubulin repertoire of Caenorhabditis elegans sensory neurons and its context-dependent role in process outgrowth.</a> Mol. Biol. Cell. 27 (23), 3717-3728 (2016).</li>
<li>Goodman, M. B., Ernstrom, G. G., Chelur, D. S., O'hagan, R., Yao, C. A., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEC-2+regulates+C.+elegans+DEG%2FENaC+channels+needed+for+mechanosensation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MEC-2 regulates C. elegans DEG/ENaC channels needed for mechanosensation.</a> Nature. 415 (6875), 1039-1042 (2002).</li>
<li>Nekimken, A., Fehlauer, H., Kim, A., Goodman, M., Pruitt, B. L., Krieg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. , (2017).</li>
<li>Brower, K., White, A. K., Fordyce, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-step+Variable+Height+Photolithography+for+Valved+Multilayer+Microfluidic+Devices%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices.</a> J. Vis. Exp. (119), e55276(2017).</li>
<li>Jenkins, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+prototyping+of+PDMS+devices+using+SU-8+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid prototyping of PDMS devices using SU-8 lithography.</a> Methods Mol. Biol. 949 (1), 153-168 (2013).</li>
<li>Faustino, V., Catarino, S. O., Lima, R., Minas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+microfluidic+devices+by+using+low-cost+fabrication+techniques%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Biomedical microfluidic devices by using low-cost fabrication techniques: A review.</a> J. Biomech. 49 (11), 2280-2292 (2016).</li>
<li>Xia, Y., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="https://www.fkit.unizg.hr/_download/repository/Soft_litography_Whitesides_Review__aciee98.pdf">SOFT LITHOGRAPHY.</a> Annu. Rev. Mater. Sci. 28 (1), 153-184 (1998).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Cho, Y., Porto, D., Hwang, H., Grundy, L., Schafer, W. R., Lu, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+and+controlled+mechanical+stimulation+and+functional+imaging+in+vivo+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Automated and controlled mechanical stimulation and functional imaging in vivo in C. elegans.</a> Lab Chip. , (2017).</li>
<li>Edwards, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+molecular+solution+for+ultraviolet+light+detection+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel molecular solution for ultraviolet light detection in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Biol. 6 (8), 1715-1729 (2008).</li>
<li>Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Cerón, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Caenorhabditis+elegans+methods%3A+synchronization+and+observation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation.</a> J. Vis. Exp. (64), e4019(2012).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Cho, Y., Porto, D. A., Hwang, H., Grundy, L. J. <a target="_blank" href="http://www.biorxiv.org/content/early/2017/02/10/107318">High-Throughput Controlled Mechanical Stimulation and Functional Imaging In Vivo.</a> BiorXiv. , (2017).</li>
<li>Petzold, B. C., Park, S. -J., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEMS-based+force-clamp+analysis+of+the+role+of+body+stiffness+in+C.+elegans+touch+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol.+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">MEMS-based force-clamp analysis of the role of body stiffness in C. elegans touch sensation.</a> Integr. Biol. (Camb). 5 (6), 853-864 (2013).</li>
<li>Nekimken, A. L., Mazzochette, E. A., Goodman, M. B., Pruitt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forces+applied+during+classical+touch+assays+for+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Forces applied during classical touch assays for Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 12 (5), e0178080(2017).</li>
<li>Chronis, N., Zimmer, M., Bargmann, C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics+for+in+vivo+imaging+of+neuronal+and+behavioral+activity+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Microfluidics for in vivo imaging of neuronal and behavioral activity in Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 4 (9), 727-731 (2007).</li>
<li>Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+immobilization+of+physiologically+active+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Protoc. 5 (12), 1888-1902 (2010).</li>
<li>Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Lamb, A., Dabbish, N., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dielectrophoresis+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Dielectrophoresis of Caenorhabditis elegans.</a> Lab Chip. 11 (4), 599(2011).</li>
<li>Christensen, A. M., Chang-Yen, D. A., Gale, B. K. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0960-1317/15/5/005">Characterization of interconnects used in PDMS microfluidic systems.</a> J. Micromechanics Microengineering. 15 (5), 928-934 (2005).</li>
<li>Gilpin, W., Uppaluri, S., Brangwynne, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Worms+under+Pressure%3A+Bulk+Mechanical+Properties+of+C.+elegans+Are+Independent+of+the+Cuticle%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Worms under Pressure: Bulk Mechanical Properties of C. elegans Are Independent of the Cuticle.</a> Biophys. J. 108 (8), 1887-1898 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo viene illustrato un metodo per la consegna precisa stimolazione meccanica per la pelle di un verme intrappolato in un chip microfluidico. Esso è destinato a facilitare l'integrazione di stimoli fisici per rispondere alle domande biologiche e mira a snellire mechanobiology ricerca nei laboratori biologici. Questo metodo estende precedenti saggi per valutare la funzione dei neuroni che mechanosensory in c. elegans. Tecniche quantitative e semi-quantitativa precedenti misurato le forze<sup class="...

Il senso del tatto fornisce animali con informazioni cruciali per il loro ambiente. A seconda della forza applicata, tocco è percepito come innocuo, piacevole o doloroso. La deformazione del tessuto durante il tocco viene rilevata da cellule specializzate Meccanocettore incorporate nella pelle che esprimono proteine recettoriali, più comunemente i canali ionici. I passaggi che collegano percezione della forza di attivazione dei canali ionici durante il tocco e il dolore completamente non sono capiti. Ancor meno è conosciuto circa come il tessuto della pelle filtri deformazione meccanica e se meccanorecettori per rilevare le modifiche nel ceppo o stress1,2,3. Questo scarto nella comprensione deriva, in parte, da una mancanza di strumenti adeguati per applicare precise stimolazioni meccaniche sulla superficie della pelle di un animale vivente osservando le risposte a livello cellulare. Considerando che la microscopia a forza atomica è stata usata estesamente per applicare e misurare le forze in cellule isolate4,5 e anche per attivare recettori Piezo1 in vita cellule6, esperimenti simili utilizzando animali viventi, soprattutto C. elegans, sono stati notoriamente impegnativo a causa della mobilità intrinseca del soggetto. Questa sfida è tradizionalmente aggirata utilizzando colla del cianoacrilato veterinaria - o -grado chirurgico per immobilizzare i singoli animali agar pastiglie1,7,8,9. Questo approccio è stato produttivo, ma ha limitazioni legate all'abilità necessaria per immobilizzazione di incollaggio e la superficie di agar molle su fattori meccanici. Una strategia di microfluidica è un'alternativa gratuita che consente di evitare alcune delle complicazioni legate a incollaggio.
Il nematode c. elegans è un organismo modello genetico con un sistema nervoso completamente mappato che, a causa delle dimensioni dell'animale, è una buona misura per la tecnologia microfluidica. Offerta di dispositivi basati su microfluidica il vantaggio che gli animali altrimenti estremamente mobili possono essere trattenuti durante l'esecuzione di imaging ad alta risoluzione e la consegna di stimoli neuro-modulatori rilevanti. Con l'aiuto di microfluidica tecnologie, animali viventi possono essere immobilizzati senza danno10,11, consentendo il monitoraggio di attività comportamentali sopra l'intero ciclo di vita12,13 e ad alta risoluzione Imaging di attività neuronale14,15,16,17. Ulteriormente, molti neuroni Meccanocettore necessari per il senso del tatto e dolore può essere caratterizzato il loro fisiologico1,8, meccanico4,18,19e molecolare livello20,21,22.
C. elegans sensi dolci stimoli meccanici alla sua parete di corpo usando sei TRNs, tre dei quali innervano l'animale anteriore (ALML/R e AVM) e tre delle quali innervano posteriore dell'animale (PLML/R e PVM). Le molecole di canale di ioni necessari per trasdurre una forza applicata in un segnale biochimico sono state studiate estesamente in suoi TRNs8. Questo articolo presenta una piattaforma di microfluidica23 che consente ai ricercatori di applicare forze meccaniche precisione sulla pelle di un immobilizzato c. elegans ascaridi, durante la lettura fuori la deformazione dei suoi tessuti interni di imaging ottico. Oltre a presentare ben definiti stimoli meccanici, transienti di calcio possono essere registrate in neuroni di Meccanocettore con risoluzione subcellulare e correlati con caratteristiche morfologiche e anatomiche. Il dispositivo è costituito da un canale centrale dell'intrappolamento che contiene un singolo animale e presenta la sua pelle accanto a sei canali di azionamento pneumatico (Figura 1 e Figura 2). I sei canali sono posizionati lungo il canale di registrazione dei colori per fornire stimoli meccanici a ciascuna delle sei TRNs del verme. Questi canali sono separati dalla camera di intrappolamento da sottili diaframmi PDMS, che possono essere azionati da una sorgente di pressione dell'aria esterna (Figura 1). Abbiamo calibrato la deviazione rispetto alla pressione e fornire le misure in questo articolo. Ogni attuatore può essere indirizzato singolarmente e usato per stimolare un Meccanocettore di scelta. La pressione viene recapitata tramite una pompa di pressione piezo-driven, ma può essere usato qualunque dispositivo alternativo. Indichiamo che il protocollo di pressione può essere utilizzato per attivare TRNs in vivo e dimostrare dispositivi di azionamento adatta per fornire stimoli meccanici per adulti di c. elegans, caricamento di animali adulti in dispositivi, esecuzione di formazione immagine del calcio esperimenti e analisi dei risultati. Fabbricazione di dispositivi è costituito da due fasi principali: 1) fotolitografia per fare uno stampo da SU-8; e 2) stampaggio PDMS per rendere un dispositivo. Per ragioni di brevità e chiarezza, i lettori sono indicati precedentemente pubblicati articoli e protocolli24,25 per istruzioni su come produrre le muffe e i dispositivi.

<table><tbody><tr><td>Maschera cromata</td><td>Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)</td><td></td><td>5'', progettata in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>Maschera cromata</td><td>Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)</td><td></td><td>5'', progettata in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>Mascherina cromata</td><td>Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/</td><td></td> <td>5'', progettata in AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>Wafer di silicio da 4 '' (B-test)</td> <td>Stanford Nanofabrication Facility</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2002</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin-coater</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-400BZ-6NPP / LITE</td><td></td></tr><tr><td>Timer di esposizione</td><td>Optical Associates, Inc</td><td>OAI 150</td><td></td></tr><tr><td>Controller</td> <td>di illuminazioneOptical Associates, Inc</td><td>2105C2</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 sviluppatore</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-propanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A426F-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>triclorometilsilano (TCMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92361-500ML</td><td>Attenzione: TCMS è tossico e reattivo all'acqua</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Elastomero Kit</td><td>Dow Punzone</td> per biopsia <td>in prepolimero</td>Corning <td></td> PDMS</tr><tr><td>, 1 mm</td><td>VWR</td><td>95039-090</td><td></td></tr><tr><td>Oxygen Plasma Asher</td><td>Branson/IPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piccolo tubo metallico (0,635 mm OD, 0,4318 mm ID, 12,7 mm di lunghezza); misura del calibro 23TW</td><td>New England Small Tube Corporation</td><td>NE-1300-01</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa Nalgene, 0,22 &mu; m</td><td>Thermo Scientific</td><td>725-2520</td><td>per filtrare tutta la soluzione, piccole particelle ostruirebbero il chip</td></tr><tr><td>Tubo in polietilene; 0,9652 mm OD, 0,5842 mm ID</td><td>Siringa Solomon Scientific</td><td>BPE-T50</td><td></td></tr><tr><td>, 1 ml</td><td>BD Scientific</td> 309628 <td>per l'intrappolamento e il rilascio</td>dei <td></td></tr><tr><td>vermi, 20 ml</td><td>BD Scientific</td><td>309661</td><td>per flusso gravitazionale</td></tr><tr><td>Gilson Minipuls 3, peristaltico </td><td>pompa Gilson</td><td></td><td>per aspirare soluzioni e vermi dal chip</td></tr><tr><td>Regolatore di flusso microfluidico, dotato di 0&ndash; Canale di pressione da 800 kPa</td><td>Uscita di pressione</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3</td></tr><tr><td>Tubo in poliuretano trasparente resistente all'acqua, diametro interno di 4 mm e diametro esterno di 6 mm</td><td>Collegamento McMaster-Carr</td><td>5195 T52</td><td>dall'aria domestica alla pompa a pressione</td></tr><tr><td>Tubo in poliuretano trasparente resistente all'acqua, diametro interno di 2,6 mm e diametro esterno di 4 mm</td><td>McMaster-Carr</td><td>5195 T51</td><td>collega la pompa a pressione a un tubo piccolo</td></tr><tr><td>Raccordo per tubo push-to-connect per aria</td><td>McMaster-Carr</td><td>5111K468</td><td>metrico - convertitore imperiale</td></tr><tr><td>Connettore diritto per 6 mm &times; 1/4&Prime; Tubo OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5779 K258</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di microscopia Leica DMI 4000 B</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63&times;/1.32 NA HCX PL APO obiettivo olio</td><td>Leica</td><td>506081</td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu Fotocamera CMOS digitale Orca-Flash 4.0LT</td><td>Hamamatsu</td><td>C11440-42U</td><td></td></tr><tr><td>Lumencor Spectra X light engine</td><td>Lumencor</td><td></td><td>Con sorgente luminosa ciano e verde/giallo</td></tr><tr><td>Divisore di fascio di eccitazione</td><td>Chroma</td><td>59022bs</td><td>al microscopio</td></tr><tr><td>Hamamatsu W-view Gemini Ottica di divisione delle immagini</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>per dividere l'emissione verde e rossa e proiettarle su diverse aree del chip della fotocamera</td></tr><tr><td>Divisore di fascio di emissione</td><td>Chroma</td><td>T570lpxr</td><td>nel divisore di immagini</td></tr><tr><td>Filtri di emissione GCamp6s</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td>nello splitter di immagini</td></tr><tr><td>Filtri di emissione mCherry</td><td>Chroma</td><td>ET632/60m</td><td>nello splitter di immagini</td></tr></tbody></table>

utilizzando un dispositivo di microfluidica per stimolazione meccanica e alta risoluzione imaging di c. elegans

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

Uno degli obiettivi centro di mechanobiology è capire l'effetto reciproco di stress meccanico sulle cellule e proteine. Nonostante la sua importanza, l'influenza dello stress meccanico sulla funzione cellulare è ancora capito male. In parte, questa lacuna di conoscenza esiste perché alcuni strumenti attivare deformazione simultanea di tessuti e cellule, imaging di attività cellulare negli animali vivi ed efficiente limitazione della motilità in organismi modello altrimenti altamente mobile, come il nematode Caenorhabditis elegans. Le piccole dimensioni di c. elegans li rendono un'eccellente corrispondenza ai dispositivi di ricerca basata su microfluidica, e soluzioni per l'immobilizzazione sono stati presentati utilizzando dispositivi microfluidici. Anche se questi dispositivi consentono l'imaging ad alta risoluzione, l'animale è completamente racchiuso in polidimetilsilossano (PDMS) e vetro, limitando l'accesso fisico per la consegna di forza meccanica o registrazioni elettrofisiologiche. Recentemente, abbiamo creato un dispositivo che integra attuatori pneumatici con un disegno di intrappolamento che è compatibile con microscopia di fluorescenza ad alta risoluzione. Il canale di azionamento è separato dal canale di registrazione di vite senza fine da una sottile membrana PDMS. Questa membrana è deviato sul fianco di un verme applicando pressione da un'origine esterna. Il dispositivo può indirizzare mechanosensitive singoli neuroni. L'attivazione di questi neuroni è ripreso in alta risoluzione con indicatori di calcio geneticamente codificato. Questo articolo presenta il metodo generale usando ceppi di c. elegans esprimendo indicatore attività calcio-sensibile (GCaMP6s) nel loro neuroni recettori di tocco (TRNs). Il metodo, tuttavia, non è limitato a TRNs né ai sensori di calcio come una sonda, ma può essere esteso ad altre cellule sensibili meccanicamente o sensori.

Litografia SU-8 e Chip Bonding Il protocollo di litografia e stampaggio PDMS seguire le procedure standard. Dettagli possono essere trovati altrove23,24,25,26. Il PDMS dovrebbe staccare la cialda senza problemi dopo l'indurimento. Se le caratteristiche di SU-8 strappare durante il peeling PDMS, o lo strato di adesione SU-8 o la silanizzazione...

Nuovi strumenti per la ricerca di mechanobiology sono necessari per capire lo stress come meccanico attiva vie biochimiche e suscita risposte biologiche. Qui, presenteremo un nuovo metodo per stimolazione meccanica selettiva degli animali immobilizzati con una trappola di microfluidica permettendo di imaging ad alta risoluzione delle risposte cellulari.

Utilizzando un dispositivo di microfluidica per stimolazione meccanica e alta risoluzione Imaging di c. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è misurare il modo in cui i nematodi e i loro neuroni rispondono a stimoli meccanici esterni utilizzando una configurazione di chip microfluidico con attuatori di pressione. Questo metodo può rispondere a domande chiave nei campi della meccanobiologia e della biologia sensoriale, come ad esempio il modo in cui le cellule, i tessuti e gli animali rispondono alla stimolazione meccanica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che riduce sufficientemente la mobilità del verme in modo non invasivo da consentire l'imaging ad alta risoluzione pur avendo accesso alla cuticola del verme per la stimolazione meccanica.Questo metodo può essere utilizzato anche per studiare l'influenza dei segnali meccanici sullo sviluppo. Potrebbe anche essere applicato ad altri sistemi come l'esposizione di organi ex vivo o altri animali di dimensioni simili a C.Elegans. Configura un sistema di microscopio per l'eccitazione simultanea di GCaMP e RFP.Un'opzione è una fonte di luce discreta che trasmette solo luce ciano e gialla. Per la visualizzazione, utilizzare un obiettivo 10x e un obiettivo ad alto ingrandimento. Inoltre, invia l'immagine a un computer tramite fo

using-microfluidics-device-for-mechanical-stimulation-high-resolution

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Un semplice dispositivo microfluidico è stato sviluppato per eseguire anestetico...

Semplici dispositivi microfluidici per<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging di<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; E Zebrafish

I ricercatori possono innescare un movimento su richiesta in C. elegans applicando un campo elettrico che i vermi percepiscono e a cui rispondono. Questo video introduce il comportamento elettrotattico e mostra un protocollo campione che viene eseguito in un dispositivo microfluidico.

Saggio di elettrotassi: un metodo per osservare la locomozione in C. elegans

Un metodo di micro-elettro-fluidico semiautomatico per indurre on-demand locomozione...

Electrotaxis microfluidica-based per On-demand analisi quantitativa della<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

L'uso di un "chip olfattivo" adattato per l'imaging del calcio efficiente dei maschi di c. elegans è descritto qui. Sono indicati anche gli studi di esposizione maschio a glicerolo e ad un feromone.

Tramite un Chip olfattiva di microfluidica adattato per l'Imaging dell'attività neuronale in risposta ai feromoni in neuroni di testa maschio C. Elegans

In questo articolo, dimostriamo live imaging dei singoli vermi che impiegano un dispositivo microfluidico personalizzato. Nel dispositivo, più vermi individualmente sono confinati per separare chambers, permettendo multiplex sorveglianza longitudinale di vari processi biologici.

Una piattaforma microfluidica per Imaging longitudinale in Caenorhabditis elegans

Una serie di metodi di immobilizzazione è stata stabilita per consentire l'irradiazione mirata di live Caenorhabditis elegans individui che utilizzano un microfluidici recentemente sviluppati polidimetilsilossano ultra-sottile chip con ritenzione idrica. Questa romanzo immobilizzazione su chip è anche sufficiente per osservazioni di imaging. Il trattamento dettagliata ed esempi di applicazione del chip sono spiegati.

Immobilizzazione degli individui Live Caenorhabditis elegans utilizzando un Chip microfluidico Polydimethylsiloxane di ultra-sottile con ritenzione idrica

Il protocollo descrive una semplice progettazione di chip microfluidici e una metodologia di microfabbricazione utilizzata per coltivare C. elegans in presenza di una fornitura continua di cibo fino a 36 ore. Il dispositivo di crescita e imaging consente inoltre l'imaging intermittente ad alta risoluzione a lungo termine dei processi cellulari e subcellulari durante lo sviluppo per diversi giorni.

Un semplice chip microfluidico per la crescita a lungo termine e l'imaging di Caenorhabditis elegans

Il presente protocollo descrive la progettazione, la fabbricazione e la caratterizzazione di un sistema microfluidico in grado di allineare, immobilizzare e comprimere con precisione centinaia di embrioni di Drosophila melanogaster con un intervento minimo da parte dell'utente. Questo sistema consente l'imaging ad alta risoluzione e il recupero di campioni per l'analisi post-stimolazione e può essere scalato per adattarsi ad altri sistemi biologici multicellulari.

Meccanostimolazione di organismi pluricellulari attraverso un sistema di compressione microfluidica ad alta produttività

Presentiamo un metodo per la stimolazione chimica e multimodale flessibile e la registrazione dell'attività neurale simultanea da molti vermi Caenorhabditis elegans . Questo metodo utilizza microfluidica, hardware e software open source e analisi automatizzata dei dati supervisionata per consentire la misurazione di fenomeni neuronali come l'adattamento, l'inibizione temporale e la diafonia dello stimolo.

Stimolazione multimodale automatizzata e registrazione neuronale simultanea da più piccoli organismi

Questo protocollo descrive l'imaging time-lapse basato su microfluidica di C. elegans durante l'intero sviluppo post-embrionale.

Imaging ad alta risoluzione di C. elegans in tutti gli stadi larvali

Scopri la stimolazione meccanica selettiva di nematodi immobilizzati tramite microfluidica per l'imaging ad alta risoluzione delle risposte neuronali in C. elegans. Questa tecnica avanza la ricerca in meccanobiologia.

Utilizzando un dispositivo di microfluidica per stimolazione meccanica e alta risoluzione Imaging di c. elegans

Esplora altri video