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$$\longrightharp{xx}$$,
Inizia posizionando i componenti del macina tessuti sul ghiaccio. Questo dispositivo include un mortaio e due pestelli di diverso diametro.
Versare un tampone di sale freddo nel mortaio e poi aggiungere il tessuto cerebrale del topo.
Il tampone mantiene l'equilibrio osmotico, preservando la struttura e la funzione cellulare.
Macina il tessuto con più colpi delicati usando il pestello di diametro più piccolo, che taglia meccanicamente il tessuto in pezzi più piccoli.
Quindi, accarezzare con il pestello di diametro maggiore, facilitando l'ulteriore scomposizione del tessuto nelle cellule che lo compongono.
Trasferire il composto in una provetta e centrifugare.
Rimuovere il surnatante.
Aggiungere il tampone salino freddo e il vortice per rompere i grumi cellulari e la mielina.
Quindi, aggiungere un mezzo di gradiente di densità e centrifugare.
A causa delle differenze di forma e massa, le cellule si depositeranno nello strato inferiore, mentre i detriti e la mielina si accumuleranno nello strato superiore.
Scartare il surnatante.
Aggiungere una soluzione adatta per ottenere una sospensione a più celle per un ulteriore utilizzo.
Per l'omogeneizzazione dei tessuti, aggiungere 3 millilitri di HBSS preraffreddato alla malta di vetro preraffreddata di un macinatore di tessuti Dounce e trasferire la metà di uno dei cervelli raccolti nel mortaio. Macerare delicatamente il tessuto con 10 colpi di pestello A, seguiti da 10 colpi di pestello B, e trasferire la miscela omogeneizzata in un nuovo tubo conico da 15 millilitri.
Riempire la provetta fino a un volume finale di 10 millilitri con HBSS preraffreddato per la centrifugazione e risospendere il pellet in 7 millilitri di HBSS fresco con vortex prima di tenere il campione sul ghiaccio. Per la rimozione dei detriti, aggiungere 3 millilitri di soluzione isotonica prerefrigerata a ciascun campione digerito o omogeneizzato e agitare delicatamente i campioni per assicurarsi che siano miscelati in modo omogeneo.
Successivamente, centrifugare i campioni e rimuovere con cura il disco biancastro di detriti e mielina che galleggia sulla superficie della soluzione. Quando i detriti sono stati scartati, raccogliere tutti i microlitri di surnatante da ciascun tubo senza disturbare i pellet. Risospendere ogni pellet in 1 millilitro di soluzione FACS/BL per il trasferimento in singole provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri.
Dopo la centrifugazione con la soluzione di particelle, è importante rimuovere il disco di detriti e il surnatante con molta attenzione, senza spostare il pellet della cella, per evitare la perdita di campione.
Dopo la centrifugazione, aspirare con cura il surnatante da ciascuna provetta e risospendere i pellet in 350 microlitri di FACS/BL fresco per provetta.