Isolamento di cellule mononucleate dal cervello di topo: una tecnica di centrifugazione a gradiente di densità per isolare le cellule mononucleate residenti nel cervello

Le cellule mononucleate nel cervello, che comprendono linfociti e monociti, svolgono un ruolo cruciale nel mantenimento della funzione cerebrale e dell'omeostasi.

Per isolare queste cellule mononucleate, in primo luogo, prendere un cervello di topo appena raccolto e perfuso con soluzione fisiologica.

La perfusione consente la rimozione del sangue e dei suoi componenti dai vasi sanguigni, consentendo l'isolamento delle cellule immunitarie residenti nel cervello nelle fasi successive.

Ora, sciacquare il cervello con un terreno adatto per rimuovere i globuli rossi aderenti. Seguire il risciacquo con la macinazione per acquisire piccoli pezzi di tessuto.

Omogeneizzare i pezzi di tessuto per ottenere una sospensione di singole cellule e frammenti cellulari.

A questa sospensione, aggiungere quindi il mezzo refrigerato e il mezzo di gradiente di densità adatto in volumi appropriati per formare un mezzo di gradiente a bassa densità.

Quindi, aggiungere un volume specifico di un mezzo gradiente ad alta densità; il mezzo gradiente ad alta densità forma uno strato separato nella parte inferiore, creando un gradiente di densità discontinuo.

Centrifugare la sospensione ad alta velocità e in condizioni di bassa temperatura. Le celle mononucleate occupano l'interfaccia tra i due strati di media a gradiente di densità.

Scartare lo strato superiore contenente i detriti cellulari e la mielina, la guaina del tessuto adiposo che circonda gli assoni delle cellule nervose.

Trasferire lo strato di interfaccia in una provetta nuova contenente un terreno adatto e una centrifuga.

Le cellule mononucleate purificate sedimentano sotto forma di pellet e possono essere risospese in tampone per ulteriori analisi.

Tagliare con cura il cranio dal naso al collo e trasferire il cervello di ogni animale dalla scatola cranica in singole provette da 50 millilitri contenenti 10 millilitri di terreno RPMI.

Mescolare bene le provette per rimuovere i globuli rossi aderenti e rimuovere il terreno mediante aspirazione. Aggiungere 10 millilitri di terreno fresco in ogni tubo e trasferire il cervello in singoli piatti da 100 millimetri.

Tritare finemente ogni cervello con un rasoio e utilizzare una pipetta di plastica per trasferire la maggior quantità di tessuto da un piatto alla volta in 6 millilitri di terreno in un omogeneizzatore di vetro sinterizzato ghiacciato da 7 millilitri.

Macinare il cervello usando lo stantuffo "allentato" del pestello prima di utilizzare lo stantuffo "stretto" per portare il tessuto fino a quando la sospensione non è omogenea. Quindi, versare l'impasto tissutale risultante in un tubo conico da 15 millilitri preraffreddato su ghiaccio.

Quando tutti i campioni sono stati omogeneizzati, regolare il volume di ciascuna provetta a 7 millilitri con terreno fresco prima di aggiungere ciascuna sospensione tissutale a una nuova provetta refrigerata da 15 millilitri contenente 3 millilitri di matrice a membrana basale al 100% per provetta.

Mescolare per inversione alcune volte e utilizzare una pipetta da 3 millilitri per aggiungere con attenzione e lentamente 1 millilitro di soluzione a gradiente di densità al 70% sotto ogni campione di soluzione tissutale.

Separare le cellule mediante centrifugazione in gradiente di densità e rimuovere quasi tutto lo strato superiore, avendo cura di rimuovere completamente tutta la mielina.

Trasferire l'interfaccia in un nuovo tubo da 15 millilitri e regolare il volume a 10 millilitri con terreno fresco. Quindi, centrifugare nuovamente i campioni e rimuovere il surnatante prima di risospendere i pellet in circa 100 microlitri di terreno per provetta.

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