Imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in un topo sveglio

Cominciamo con un topo transgenico fissato in una cornice stereotassica, con una finestra cranica impiantata sulla sua corteccia visiva.

Il topo esprime EGFP nella microglia e R-CaMP, un indicatore di calcio fluorescente rosso, nei neuroni della corteccia visiva.

Posiziona il mouse sotto un microscopio a due fotoni e regola la lente dell'obiettivo per mettere a fuoco la superficie del cervello.

Spostare il mouse con la cornice stereotassica dalla lente dell'obiettivo e collegare un dispositivo di ombreggiatura.

Riempire il dispositivo di ombreggiatura con acqua e riposizionare il mouse sotto il microscopio.

Coprire la lente con una pellicola nera.

Il dispositivo di ombreggiatura e la pellicola bloccano le interferenze della luce esterna, garantendo immagini accurate.

Posizionare un monitor LCD davanti all'occhio del mouse per fornire una stimolazione visiva.

Impostare i parametri di imaging e iniziare l'imaging.

La stimolazione visiva innesca l'eccitazione neuronale, portando all'afflusso di calcio e ad un aumento della fluorescenza R-CaMP.

Nel frattempo, le microglia ritraggono i loro processi mentre interagiscono con i neuroni attivati, come osservato attraverso l'imaging dal vivo.

Per installare il dispositivo di ombreggiatura su misura e un monitor LCD per la stimolazione visiva, posizionare innanzitutto la lente in modo che si concentri sulla superficie del cervello. E poi impostare questa posizione dell'obiettivo come la posizione z originale. Mantieni costanti le coordinate x e y ed eleva la lente dell'obiettivo. Rimuovere il mouse e lo strumento stereotassico dalla lente dell'obiettivo. Fissare un dispositivo di ombreggiatura sulla parte superiore della piastra di sterzo utilizzando del silicone, assicurandosi che lo spazio tra la piastra di sterzo e il dispositivo di ombreggiatura sia ben sigillato.

Riempire il dispositivo di ombreggiatura con acqua distillata. Quindi, fissare il mouse con la cornice stereotassica sotto la lente dell'obiettivo. Reimpostare con cura il piano focale sulla superficie del cervello, controllando la profondità della lente dell'obiettivo. Coprire la lente dell'obiettivo con un foglio di alluminio nero per evitare la contaminazione della luce dal monitor LCD. Imposta un monitor LCD da 10 pollici a 12,5 centimetri davanti agli occhi del mouse per presentare gli stimoli visivi.

Configura i filtri di raccolta dell'emissione di fluorescenza per EGFP e RCaMP e la lunghezza d'onda di eccitazione a 1.000 nanometri. Acquisisci immagini con una risoluzione spaziale di 0,25 micron per pixel. Trova la regione di imaging in cui i neuroni RCaMP-positivi e la microglia EGFP-positiva possono essere visualizzati contemporaneamente nello strato 2/3.

Acquisisci immagini alla frequenza dei fotogrammi di 30 Hertz. Contemporaneamente, con l'acquisizione dell'immagine, presenta al mouse stimoli visivi a reticolo alla deriva in 12 direzioni con 6 orientamenti da 0 a 150 gradi con incrementi di 30 gradi.