Imaging in vivo a due fotoni della dinamica microgliale nell'ippocampo del topo

Prendi un topo transgenico anestetizzato che esprime proteine fluorescenti nella microglia. Fissarlo su un telaio stereotassico con un tavolino motorizzato sotto un microscopio a due fotoni.

Il cranio è dotato di un tubo metallico con fondo di vetro che appiattisce delicatamente l'alveo sopra la regione dell'ammonide 1 o CA1 del corno ippocampale, garantendo un'interfaccia ottica chiara senza

un'eccessiva pressione sul tessuto sottostante.

Riempire il tubo metallico con acqua per ottimizzare la trasmissione ottica.

Attivare il laser pulsato alla lunghezza d'onda di eccitazione.

Utilizzando la fluorescenza dal parenchima cerebrale e la luce riflessa dal tubo metallico, regolare la messa a fuoco sulla regione CA1.

Riposizionare la testa del mouse per allineare il fondo del vetro parallelamente al piano di imaging, garantendo una messa a fuoco uniforme su tutto il campo visivo.

Regolare l'obiettivo per una risoluzione ottimale e osservare le dinamiche microgliali in vivo nella regione CA1.

Successivamente, visualizza il giro dentato, dove le microglia fluorescenti confermano l'integrità di CA1.

Posizionare il mouse nel dispositivo di supporto della testa sotto la lente dell'obiettivo del microscopio a due fotoni e sul tavolino di scansione XY motorizzato. Quindi riempire lo spazio tra il fondo in vetro e la lente dell'obiettivo con acqua senza creare bolle d'aria. Regolare la messa a fuoco, su CA1 con la guida della fluorescenza emessa dal parenchima cerebrale e della luce riflessa dal bordo del tubo metallico, sotto l'illuminazione continua del laser pulsato.

Regolare l'angolazione della testa del mouse inclinando il dispositivo di supporto della testa in modo che la parte inferiore del vetro sia parallela al piano di imaging. Quindi, regolare il collare di correzione dell'obiettivo per ottenere la massima risoluzione a una profondità della struttura target nel CA1. Successivamente, confermare che le cellule fluorescenti nello strato molecolare del giro dentato, o DG, a una profondità di 500 micrometri dal fondo del vetro, siano visualizzate nell'intero campo visivo. Solo in caso di intervento chirurgico riuscito, i segnali DG possono essere rilevati immediatamente.

Assicurarsi che le microglia abbiano recuperato la loro morfologia ramificata. Quindi eseguire l'imaging in vivo sullo strato di interesse nel CA1.