Visualizzazione dell'afflusso di calcio nei neuroni ventrali del mesencefalo derivati da embrioni di topo

Prendi un vetrino coprioggetti con una coltura di neuroni ventrali del mesencefalo derivati da embrioni di topo.

Le cellule vengono infettate con un vettore virale per esprimere un indicatore di calcio.

Trasferire il vetrino coprioggetti nella camera di registrazione di un microscopio confocale perfuso con un tampone di registrazione.

Utilizzando la luce visibile, identifica una regione contenente più neuroni, quindi passa all'imaging a fluorescenza.

A bassi livelli intracellulari di calcio, l'indicatore rimane non legato, mostrando una bassa intensità di fluorescenza.

Le proprietà intrinseche dei neuroni generano potenziali d'azione spontanei, innescando l'apertura dei canali del calcio voltaggio-dipendenti e consentendo l'afflusso di calcio.

L'eccesso di calcio si lega all'indicatore, inducendo un cambiamento conformazionale che aumenta l'intensità della fluorescenza.

Registra l'intensità della fluorescenza nel tempo per monitorare l'attività spontanea del calcio.

Introdurre un neurotrasmettitore ad alta concentrazione, che si lega ai recettori sui neuroni, generando potenziali d'azione continui.

L'attivazione prolungata del canale del calcio voltaggio-dipendente prolunga l'afflusso di calcio, causando un aumento sostenuto dell'intensità della fluorescenza.

Preparare 1 litro di tampone di registrazione HEPES, 200 millilitri di tampone di registrazione del glutammato 20 micromolare e 200 millilitri di tampone di registrazione NBQX 10 micromolari secondo le indicazioni del manoscritto. Riempire una piastra di Petri sterile da un millimetro con 3 millilitri di tampone di registrazione.

Prelevare la capsula di Petri con le colture infette dall'incubatrice, quindi afferrare con cautela il bordo di un vetrino coprioggetti con una pinza a punta fine e trasferirla nella piastra con il tampone di registrazione. Riposizionare il vetrino rimanente nel terreno nell'incubatrice a 37 gradi Celsius e trasportare la piastra con il tampone di registrazione al microscopio confocale.

Avviare il software di imaging. Durante l'inizializzazione, avviare la pompa peristaltica e posizionare la linea nel buffer di registrazione. Quindi calibrare il flusso a 2 millilitri al minuto. Trasferire il vetrino coprioggetti infetto dalla capsula di Petri al bagno di registrazione con una pinza fine. Utilizzando l'obiettivo a immersione in acqua 10x e la luce in campo chiaro, trova il piano di messa a fuoco e cerca una regione con un'alta densità di corpi cellulari neuronali. Quindi passare all'obiettivo 40X e rifocalizzare il campione.

Seleziona e applica Alexa Flour 488 nella finestra dell'elenco dei coloranti. Per evitare la sovraesposizione e il fotosbiancamento dei fluorofori, iniziare con impostazioni di bassa HV e potenza del laser. Per il canale Alexa Fluor 488, imposta l'HV su 500, il guadagno su 1x e l'offset su zero. Impostare la potenza al 5% per la linea laser 488, aumentare la dimensione del foro stenopeico a 300 micrometri e utilizzare l'opzione di scansione focus x2 per regolare in modo ottimale i segnali di emissione a livelli inferiori a saturazione.

Le impostazioni possono quindi essere regolate per una visibilità ottimale di ciascun canale. Una volta ottimizzate le impostazioni del microscopio, spostare il tavolino per individuare una regione con più cellule che mostrano cambiamenti spontanei nella fluorescenza GCaMP6f e concentrarsi sul piano desiderato per l'imaging. Utilizzare lo strumento clip rect per ritagliare il fotogramma dell'immagine a una dimensione che possa raggiungere un intervallo di fotogrammi di poco inferiore a un secondo. Impostare la finestra intervallo su un valore di 1,0 e la finestra Num su 600.

Per acquisire un filmato della serie t, selezionare l'opzione tempo, quindi utilizzare l'opzione di scansione XYt per avviare l'imaging. Osservare la barra di avanzamento dell'imaging e spostare la linea dal tampone di registrazione HEPES al tampone di registrazione del glutammato da 20 micromolari al momento appropriato. Al termine dell'imaging, selezionare il pulsante Fine serie e salvare il filmato della serie T finito. Continuare a perfondere il glutammato per altri cinque minuti, in modo che i neuroni in coltura siano stati esposti al glutammato per un totale di 10 minuti.

Ripetere questa procedura per ogni vetrino coprioggetti da riprodurre. È possibile visualizzare tracce di calcio nei corpi cellulari neuronali immediatamente dopo l'esperimento. Usa lo strumento ellisse per disegnare il numero desiderato di ROI attorno al soma neuronale e usa il pulsante di analisi della serie per visualizzare le tracce. Dopo gli ulteriori cinque minuti di esposizione al glutammato, rimuovere il vetrino coprioggetti dal bagno con una pinza fine e riposizionarlo nella piastra di Petri con il tampone di registrazione fino al completamento di tutte le immagini.