Imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale in topi svegli
August 23rd, 2022
Qui, descriviamo un protocollo che combina l'iniezione di virus adeno-associato con l'impianto di finestre craniche per l'imaging simultaneo delle dinamiche microgliali e dell'attività neuronale nei topi svegli.
Il nostro protocollo consente l'imaging simultaneo delle dinamiche della microglia e dell'attività neuronale nei topi svegli. Può essere ampiamente applicato per studiare il comportamento di sorveglianza della microglia o l'interazione con i neuroni. Il vantaggio di questo metodo è che gli artefatti di movimento non contaminano facilmente i dati di imaging a causa della robusta fissazione della testa.
Inoltre, il ripristino dopo l'imaging a frame rate elevato ci consente di eliminare gli artefatti di movimento dai dati. In questo metodo, l'iniezione di AAV e la chirurgia dell'impianto della finestra cranica sono tecnicamente impegnative. Il fallimento è comune all'inizio, quindi per favore non sentirti frustrato e pratica di più.
Per preparare l'apparecchio di iniezione, posizionare una pipetta di vetro collegata a una siringa Hamilton calibro 26 attraverso un tubo su un portapipette di uno strumento stereotassico. Quindi, inclinare il portapipette di 60 gradi anteriormente rispetto all'asse verticale. Riempire la pipetta di vetro, la siringa e il tubo di collegamento con paraffina liquida e posizionare la siringa su un microiniettore.
Somministrare l'analgesia al topo anestetizzato e attaccare le barre auricolari ausiliarie. Quindi, fissa l'animale sullo strumento stereotassico con il lato dorsale verso l'alto. Dopo aver rimosso i peli dal sito chirurgico e disinfettato l'area chirurgica, praticare un'incisione lunga due centimetri sul cuoio capelluto lungo la linea mediana, garantendo una buona esposizione del cranio sopra la corteccia visiva primaria destra.
Utilizzare una pinza per rimuovere il periostio sul cranio esposto. Forare il cranio sulle coordinate stereotassiche tre millimetri lateralmente alla linea mediana e 5 millilitri anteriormente alla linea lambda per creare un piccolo foro con un diametro di circa 0,5 millimetri. Quindi, posizionare un pezzo di pellicola trasparente di circa due centimetri per due centimetri sul cranio esposto del topo.
Espellere un microlitro di goccia di soluzione AAV sul film usando un pipetter. Far avanzare la siringa. E posizionare una punta di pipetta di vetro nella goccia di soluzione AAV sul film e tirare delicatamente la siringa per aspirare la soluzione AAV.
Quindi, inserire la pipetta di vetro a una profondità di 500 micrometri dalla superficie del cervello attraverso il foro creato nel cranio. Quindi, iniettare 0,5 microlitri di soluzione AAV utilizzando il microiniettore a una portata volumetrica di iniezione di due microlitri all'ora. Ritirare l'ago e sciacquare la superficie del cervello con soluzione salina.
Creare una scanalatura circolare lungo il segno sul cranio perforando. Pulire i detriti per garantire la visibilità del cranio e applicare soluzione salina per evitare il riscaldamento durante la perforazione. Premere delicatamente il cranio centrale con una pinza.
La profondità di foratura è sufficiente se si muove verticalmente con poca resistenza. Quando il solco raggiunge una profondità sufficiente, inserire la punta della pinza nella parte inferiore del frammento centrale del cranio. Sollevarlo delicatamente e rimuoverlo per esporre la superficie del cervello.
Utilizzando un ago calibro 27, pungere e strappare la dura sul bordo della superficie cerebrale esposta. Inserire la punta della pinza attraverso il foro praticato sul bordo della dura e staccarlo per esporre la superficie del cervello. Dopo aver disperso le fibre emostatiche una ad una in soluzione salina, posizionare le fibre emostatiche lungo i margini del foro in cui è presente la dura transettata.
Posizionare la finestra cranica sulla superficie cerebrale esposta e quindi farla aderire al cranio con colla istantanea mentre si preme delicatamente la finestra. Successivamente, applicare la colla istantanea su tutto il cranio esposto. Quindi, attaccare con attenzione una piastra di testa sul cranio per individuare la finestra cranica al centro del foro quadrato della piastra della testa.
Una volta che la colla si è sufficientemente indurita, applicare il cemento dentale sul cranio esposto per rinforzare l'attacco tra la testa e la lama della testa. Per installare il dispositivo di ombreggiatura personalizzato e un monitor LCD per la stimolazione visiva, posizionare prima l'obiettivo per mettere a fuoco la superficie del cervello e quindi impostare questa posizione della lente come posizione Z originale. Mantieni costanti le coordinate XY ed eleva l'obiettivo.
Rimuovere il mouse e lo strumento stereotassico dall'obiettivo. Fissare un dispositivo di ombreggiatura sulla parte superiore della piastra di testa utilizzando silicone, assicurandosi che lo spazio tra la piastra di testa e il dispositivo di ombreggiatura sia ben sigillato. Riempire il dispositivo di ombreggiatura con acqua distillata.
Quindi, fissare il mouse con la cornice stereotassica sotto l'obiettivo. Ripristinare con attenzione il piano focale sulla superficie del cervello, controllando la profondità della lente dell'obiettivo. Coprire l'obiettivo con un foglio di alluminio nero per evitare la contaminazione della luce dal monitor LCD.
Impostare un monitor LCD da 10 pollici a 12,5 centimetri davanti agli occhi del mouse per presentare stimoli visivi. Configurare i filtri di raccolta di invio fluorescente per EGFP e R-CaMP e la lunghezza d'onda di eccitazione a 1.000 nanometri. Acquisisci immagini con una risoluzione spaziale di 0,25 micron per pixel.
Trova la regione di imaging in cui i neuroni R-CaMP-positivi e le microglia EGFP-positive possono essere ripresi simultaneamente. Nel livello 2, 3. Acquisisci immagini alla frequenza fotogrammi di 30 hertz.
Contemporaneamente all'acquisizione dell'immagine, presenta stimoli visivi reticolati alla deriva al mouse in 12 direzioni a sei orientamenti, da zero a 150 gradi in passi di 30 gradi. Dopo l'acquisizione dell'immagine, rimuovere il mouse dalla fase del microscopio. Staccare il dispositivo di ombreggiatura e lo strumento stereotassico dal mouse e riportare il mouse nella sua gabbia di casa.
Utilizzando questo protocollo, l'iniezione di AAV e l'impianto della finestra cranica sono stati eseguiti nella corteccia visiva primaria di un topo transgenico di otto settimane, seguiti da due immagini fotoniche dell'attività neurale basata su R-CaMP e della dinamica microgliale nello strato 2, 3. Gli stimoli visivi del reticolo sono stati presentati al topo e le risposte visive nella colonna vertebrale adendritica sono state analizzate utilizzando tracce di calcio. I processi microgliali hanno mostrato dinamiche veloci e hanno cambiato la loro morfologia entro 10 secondi.
Utilizzando l'imaging a due fotoni nello strato 2, 3 della corteccia visiva primaria in un topo transgenico di 12 settimane, R-CaMP è stato osservato nei neuroni, visto qui in magenta. Un EGFP è stato osservato in microglia, visto in verde. Sono stati osservati anche segnali individuali per EGFP e R-CaMP.
Il successo dell'iniezione di AAV è fondamentale per questo metodo. Le ragioni principali per la mancata iniezione di AAV sono le pipette di vetro dell'orologio e il danno tissutale. Il comportamento di sorveglianza sulla microglia e l'interazione della microglia dello SNAP sono stati identificati per essere prevalenti in vari meccanismi patogeni, come il morbo di Alzheimer.
Il nostro metodo è vantaggioso per la ricerca focalizzata su questo campo.
Panoramica
Questo studio delinea un protocollo che combina l'iniezione di virus adeno-associato (AAV) con l'impianto di finestra cranica per consentire l'imaging simultaneo della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in topi svegli. Il metodo permette ai ricercatori di investigare il comportamento di sorveglianza della microglia e le loro interazioni con i neuroni minimizzando gli artefatti di movimento durante l'imaging.
Componenti Chiave dello Studio
Area di Scienza
- Neuroscienza
- Neuroimaging
- Neurobiologia
Background
- La microglia svolge un ruolo essenziale nella salute e nella malattia del cervello.
- L'imaging in tempo reale della dinamica microgliale è cruciale per comprendere le loro funzioni.
- L'AAV è comunemente utilizzato per l'erogazione di materiale genetico nelle applicazioni neuroscientifiche.
- La fissazione della testa nei topi svegli riduce gli artefatti di movimento durante l'imaging.
Obiettivo dello Studio
- Sviluppare un metodo affidabile per l'imaging dell'interazione tra microglia e neuroni.
- Migliorare la comprensione della dinamica microgliale e dell'attività neuronale in condizioni fisiologiche.
- Minimizzare la contaminazione dei dati da parte di artefatti di movimento durante l'imaging.
Metodi Utilizzati
- Il protocollo prevede l'iniezione di AAV e l'impianto di finestra cranica nella corteccia visiva primaria di topi svegli.
- Il modello biologico consiste in topi transgenici che esprimono proteine fluorescenti.
- Le fasi chiave includono coordinate stereotassiche precise per l'iniezione e procedure chirurgiche per il posizionamento della finestra cranica.
- L'imaging è stato condotto utilizzando microscopia a due fotoni a una frequenza di 30 Hz.
- Le tracce di calcio da neuroni e microglia sono state analizzate in risposta a stimoli visivi.
Principali Risultati
- Sono state osservate dinamiche rapide nei processi microgliali, che hanno cambiato morfologia entro 10 secondi.
- L'imaging simultaneo ha rivelato l'attività neuronale e la dinamica microgliale in risposta agli stimoli visivi.
- Il protocollo ha convalidato l'efficacia dell'AAV e delle finestre craniche per l'imaging di alta qualità.
Conclusioni
- Questo metodo permette l'osservazione in tempo reale delle interazioni tra microglia e neuroni, fornendo informazioni sulla dinamica cerebrale.
- Lo studio contribuisce con strumenti preziosi per comprendere i ruoli della microglia nei meccanismi neuronali.
- Le applicazioni future potrebbero includere l'indagine degli effetti di vari interventi sull'attività microgliale e neuronale.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Simultaneous imaging of microglial dynamics and neuronal activity in awake mice enables direct interrogation of neuroimmune interactions at single-cell resolution. This capability supports mechanistic de-risking and predictive confidence in early CNS target validation, especially for neuroinflammatory and neurodegenerative disease models. Integrating real-time glial-neuronal readouts advances portfolio decisions by clarifying pathway engagement and functional outcomes in translationally relevant systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization of microglia-neuron interactions under physiological and stimulated conditions.
- Supports functional target validation by linking immune cell dynamics to neuronal activity in vivo.
- Facilitates mechanistic de-risking for neuroinflammatory and synaptic plasticity hypotheses.
- Improves predictive confidence for CNS target engagement and pathway modulation.
Screening & Assay Development
- Establishes validated in vivo imaging systems for quantitative assessment of neuronal and microglial responses.
- Provides reproducible, motion-artifact-minimized datasets for downstream analysis and screening.
- Enables standardization of visual stimulus protocols and imaging parameters for assay development.
- Supports reliable evaluation of compound effects on neuroimmune interactions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns preclinical models with disease-relevant neuroimmune mechanisms observed in human CNS disorders.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by tracking dynamic cellular responses.
- Supports risk-adjusted advancement of neuroinflammation and synaptic modulation programs.
- Provides translational biomarker candidates based on real-time cellular activity patterns.
Pipeline & Workflow Integration
This imaging protocol bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis-driven testing of neuroimmune interactions in awake, behaving mice.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on microglial surveillance and neuron-glia signaling in response to peripheral and central stimuli.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible imaging outputs suitable for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Provides high-resolution calcium traces and morphological data for comparative condition analysis.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease-relevant mechanisms and biomarker development.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable in vivo imaging platform adaptable to diverse CNS targets and interventions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Standardizes in vivo imaging workflows and minimizes motion artifacts for reproducible data.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of neuroimmune programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of CNS assets based on functional in vivo evidence.
Implementation Considerations
- Requires technical expertise in stereotaxic surgery, AAV delivery, and cranial window implantation.
- Demands access to two-photon microscopy and advanced imaging infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of imaging protocols and data analysis.
- Adaptable to various brain regions and transgenic models with protocol optimization.
- Initial technical failure rates may be high; proficiency improves with practice and experience.
