Quantificare i flussi^{spontanei di} Ca 2 e i loro effetti a valle nei neuroni Midbrain del topo primario

Qui presentiamo un protocollo per misurare i flussi in vitro di Ca² nei neuroni midbrain e i loro effetti a valle sulla caspase-3 utilizzando colture midbrain topo primario. Questo modello può essere utilizzato per studiare i cambiamenti patofsiologici legati all'attività anormale di Ca² nei neuroni midbrain e per lo screening di nuove terapie per le proprietà anti-apoptotiche.

Questo protocollo quantifica i flussi di calcio nei neuroni dopaminergici, che si perdono nel morbo di Parkinson. Questo è utile per capire come il calcio anomalo causa la perdita di neuroni dopaminergici nel morbo di Parkinson. Per la prima volta, dimostriamo flussi spontanei di calcio nei neuroni del midbrain primario coltivato.

Questo metodo può essere utilizzato per sezionare specifici contributi del recettore coinvolti nell'apoptosi mediata dal calcio. Il nostro metodo fornisce una strada per schermi di farmaci ad alto contenuto per scoprire composti neuroprotettivi specifici ed efficaci per il morbo di Parkinson. Questi composti neuroprotettivi prevenirebbero l'apoptosi mediata dal calcio nei neuroni dopaminergici.

Inizia preparando un millilitro di mezzo DMEM senza siero con un microlitro di hSyn-GCaMP6f AAV per piatto. Aspirare il mezzo di coltura cellulare da ogni piatto e sostituirlo con un millilitro del DMEM preparato con hSyn-GCaMP6f. Riposizionare i piatti nell'incubatore di 37 gradi Celsius per un'ora.

Dopo l'incubazione, aspirare il mezzo con AAV e sostituirlo con tre millilitri di mezzo di coltura cellulare. Incubare i piatti a 37 gradi Celsius per cinque o sette giorni. Cambiare il mezzo ogni due o tre giorni durante questo periodo di infezione virale.

Preparare un litro del buffer di registrazione HEPES, 200 millilitri di 20 buffer di registrazione del glutammato micromolare e 200 millilitri di tampone di registrazione NBQX micromolare secondo le indicazioni del manoscritto. Riempire una piastra di Petri sterile da 35 millimetri con tre millilitri del tampone di registrazione. Prendere la piastra di Petri con le colture infette dall'incubatrice, quindi afferrare attentamente il bordo di un coperchio scivolare con forcep di punta fine e trasferirlo nella piastra con il tampone di registrazione.

Riposizionare il coperchio rimanente in mezzo nell'incubatore di 37 gradi Celsius e trasportare il piatto con tampone di registrazione al microscopio confocale. Avviare il software di imaging. Durante l'inizializzazione, avviare la pompa peristaltica e posizionare la linea nel buffer di registrazione.

Quindi calibrare il flusso a due millilitri al minuto. Trasferire il coperchio infetto dalla piastra di Petri al bagno di registrazione con forcep fini. Utilizzando l'obiettivo di immersione dell'acqua 10X e la luce del campo luminoso, trova il piano di messa a fuoco e cerca una regione con un'alta densità di corpi cellulari neuronali, quindi passa all'obiettivo 40X e rifocalizza il campione.

Selezionare e applicare AlexaFluor 488 nella finestra dell'elenco Coloranti. Al fine di prevenire la sovraesposizione e lo sbiancamento fotografico dei fluorofori, iniziare con basse impostazioni di potenza HV e laser. Per il canale AlexaFluor 488, impostare l'HV su 500, il guadagno su 1x e l'offset su zero.

Impostare la potenza sul 5% per la linea laser 488. Aumentare le dimensioni del foro stenopeica a 300 micrometri e utilizzare l'opzione di scansione focus x2 per regolare in modo ottimale i segnali di emissione ai livelli di subsaturazione. Le impostazioni possono quindi essere regolate per una visibilità ottimale di ogni canale.

Una volta ottimizzate le impostazioni del microscopio, spostare lo stadio per localizzare una regione con più cellule che mostrano cambiamenti spontanei nella fluorescenza GCaMP6f e concentrarsi sul piano desiderato per l'imaging. Utilizzate lo strumento Clip rect per ritagliare il fotogramma di imaging a una dimensione che può ottenere un intervallo di fotogrammi di poco inferiore a un secondo. Impostare la finestra intervallo su un valore pari a 1,0 e la finestra Num su 600.

Per acquisire un filmato della serie T, selezionate l'opzione Tempo (Time), quindi usate l'opzione di scansione Xyt per iniziare l'imaging. Guarda la barra di stato dell'imaging e sposta la linea dal buffer di registrazione HEPES nel buffer di registrazione del glutammato micromolare 20 nel momento appropriato. Al termine dell'imaging, selezionare il pulsante di creazione della serie e salvare il filmato finito della serie T.

Continuare a perfondere il glutammato per altri cinque minuti in modo che la coltura dei neuroni sia stata esposta al glutammato per un totale di 10 minuti. Ripetere questo processo per l'immagine di ogni slittamento di copertina. È possibile visualizzare tracce di calcio e corpi cellulari neuronali immediatamente dopo l'esperimento.

Utilizzare lo strumento Ellisse per disegnare il numero desiderato di ROM attorno al soma neuronale. E utilizzare il pulsante Analisi serie per visualizzare le tracce. Dopo l'esposizione aggiuntiva di cinque minuti al glutammato, rimuovere la scivolata di copertura dal bagno con forcep fini e riposizionare nella piastra di Petri con il buffer di registrazione fino al completamento di tutte le immagini.

Il giorno dell'imaging, le colture di macchine virtuale sono state trattate con glutammato o una combinazione di glutammato e NBQX. In entrambe le condizioni, sono stati osservati cambiamenti eterogenei e spontanei nella florescenza GCaMP6f che indicano flussi spontanei di calcio. L'applicazione del glutammato ha generato una risposta al calcio robusta e sostenuta sia nei neuroni spontaneamente attivi che in quello quiescente.

L'applicazione di NBQX ha ridotto l'attività spontanea e parzialmente bloccato la risposta del glutammato. La misura in cui l'applicazione del glutammato stimolava una risposta al calcio in ogni condizione è stata quantificata usando l'area sotto la curva, l'ampiezza del picco e la latenza per rispondere. La latenza alla risposta è aumentata sotto la condizione NBQX e glutammato.

Per misurare l'apoptosi mediata dal glutammato, le cellule sono state fissate e macchiate con un anticorpo anti-Caspasi-3. L'intensità media della caspasi-3 era significativamente più alta in entrambe le condizioni di trattamento rispetto ai controlli non trattati. Un'analisi più approfondita della morte eccitata delle cellule tossiche può essere fatta contando il numero di neuroni dopaminergici positivi all'immunostain tirosina idrossilasi in controllo e condizione trattata con glutammato.

Questa tecnica ha spianato la strada alla comprensione dei contributi relativi di diversi recettori e canali di ferro coinvolti nell'apoptosi mediata dal calcio nel neurone dopaminergico.