Applicazione di un mouse legatura Patch Peyer Assay intestinale Loop per valutare assorbimento da parte delle cellule batteriche M
December 17th, 2011
Cellule M specializzato in un follicolo-associato epitelio che copre le placche di Peyer svolgono un ruolo importante per la immunosorveglianza mucosa intestinale in tessuto linfoide associato. Qui abbiamo descritto il metodo di valutazione per transcitosi batterica da parte delle cellule M In vivo. Questo metodo fornisce un metodo per capire M-funzione delle cellule del sistema immunitario.
L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare l'assorbimento batterico da parte delle cellule M situate all'interno del sistema immunitario della mucosa intestinale. Il primo passo di questa procedura consiste nell'esporre e legare le macchie di pire intestinali di un topo anestetizzato. I batteri fluorescenti vengono quindi iniettati nell'area legata.
Un'ora dopo, le macchie di pire vengono asportate. Le cellule del tessuto vengono quindi permeate e colorate per il marcatore delle cellule M, GP due. Infine, i campioni vengono osservati utilizzando un microscopio confocale e i batteri sottoposti a transcitosi da parte delle cellule M possono essere visualizzati.
Oltre a fornire informazioni sulle basi molecolari della transcitosi batterica da parte delle cellule m, il rifiuto può essere applicato ad altri sistemi. Ad esempio, questo protocollo potrebbe essere utilizzato per favorire la permeabilità cellulare e nell'intestino incorniciato utilizzando cloro e microbi Utilizzando uno spargitore di vetro sterile, striare i batteri fluorescenti su una piastra a coclea LB e incubare la piastra a 37 gradi Celsius fino a quando non sono visibili singole colonie. Prelevare una singola colonia dalla coclea solida e inocularela in due millilitri di terreno LB fresco.
Quindi coltivare i batteri su uno shaker durante la notte a 37 gradi Celsius. Una volta che la coltura starter è cresciuta, trasferire 500 microlitri di batteri in 4,5 millilitri di terreno LB e incubare questa nuova coltura a 37 gradi Celsius per tre o quattro ore o fino a quando la sua densità ottica a 600 nanometri raggiunge uno, indicando che la crescita batterica è in fase logaritmica. A questo punto, centrifugare la coltura a 3000 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per raccogliere i batteri dopo la centrifugazione, scartare la trappola e lavare il pellet con cinque millilitri di PBS sterile Dopo aver ripetuto la fase di lavaggio Resus sospendere i batteri in cinque millilitri di PBS.
Dopo aver posto il topo in anestesia continua con fluoro, utilizzare strumenti sterili per aprire asetticamente l'addome del topo. Inizia esponendo l'intestino tenue e individua le chiazze del PI. Una volta trovati i cerotti di un PI, utilizzare un filo da cucito sterile per legare l'intestino a circa cinque millimetri da un lato del cerotto.
Fare attenzione a evitare di recidere i vasi sanguigni durante la procedura. Una volta legato l'intestino, utilizzare una siringa per iniettare 50 microlitri di sospensione batterica a circa 10-7 CFU nell'anello del cerotto delle pire legate sul lato libero dell'intestino. Quindi usa il filo per legare l'altro lato dell'intestino.
Chiudere l'addome del topo con una clip e mantenere il topo sotto anestesia per un'ora prima di sopprimerlo. Per raccogliere il cerotto di pire, asportare con cura il cerotto di pire. Quindi sciacquare energicamente il PBS attraverso la sezione raccolta dell'intestino più volte per lavare il lato apicale del cerotto del PI e rimuovere il liquido mucoso e i batteri in eccesso.
Una volta lavato il cerotto del PI, posizionarlo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e aggiungere gli effetti cyto o la soluzione di permanente cyto. Incubare il campione su ghiaccio per un'ora. Una volta fissato il cerotto P'S, immergerlo in un millilitro di tampone per il lavaggio permanente per cinque minuti.
Ripetere questa fase di lavaggio tre volte. Quindi posizionare il campione in un millilitro di tampone bloccante e incubarlo su ghiaccio per 30 minuti. Dopo la fase di blocco, aggiungere l'anticorpo monoclonale anti topo GP two a una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro e incubare il campione per una notte a quattro gradi Celsius per colorare le cellule M.
Quindi, lavare il campione come prima. Aggiungere un pavimento secondario per l'anticorpo coniugato e incubare il campione su ghiaccio al buio per due ore. Una volta che il campione è colorato, lavarlo delicatamente con PBS.
Quindi posizionare tre o quattro pezzi di vetro di copertura circolare su un vetrino e incorporare il cerotto pires in 200 microlitri di una soluzione di glicerolo al 30% in PBS. Sul vetrino, utilizzare un microscopio laser confocale DM IRE a due o un microscopio a deconvoluzione per il ripristino della visione Delta per osservare il campione. In questa immagine, si può vedere la salmonella typhimurium verde marcata con GFP circondata da GP due mostrata in rosso sulla membrana plasmatica apicale.
In questa immagine ruotata, i batteri sono visibili all'interno delle vescicole citoplasmatiche subapicali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la transcitosi batterica da parte delle cellule M utilizzando il saggio Lu intestinale pys legato.
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Panoramica
Questo studio si concentra sulle cellule M nel sistema immunitario della mucosa intestinale, in particolare il loro ruolo nella transcitosi batterica. Il metodo descritto consente la valutazione della funzione delle cellule M in vivo, contribuendo alla nostra comprensione dell'immunosorveglianza mucosa.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Immunologia
- Microbiologia
- Neuroscienze
Contesto
- Le cellule M sono cellule epiteliali specializzate nelle placche di Peyer.
- Giocano un ruolo cruciale nella risposta immunitaria dell'intestino.
- Comprendere la loro funzione può fornire informazioni sulla salute e sulle malattie intestinali.
- La transcitosi batterica è un processo chiave nella sorveglianza immunitaria.
Obiettivo dello studio
- Valutare l'uptake batterico da parte delle cellule M in vivo.
- Sviluppare un metodo per studiare la funzione delle cellule M.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi di immunosorveglianza mucosa.
Metodi utilizzati
- Legatura delle placche di Peyer intestinali in topi anestetizzati.
- Iniezione di batteri fluorescenti nell'area legatura.
- Asportazione delle placche di Peyer dopo un'ora.
- Colorazione dei campioni di tessuto per il marcatore delle cellule M GP2 e osservazione con microscopia confocale.
Risultati principali
- Visualizzazione di successo della transcitosi batterica da parte delle cellule M.
- Dimostrato la fattibilità del metodo di valutazione.
- Fornito informazioni sulla funzione immunitaria delle cellule M.
- Contribuito alla comprensione del tessuto linfoide associato all'intestino.
Conclude
- Il metodo consente uno studio dettagliato della funzione delle cellule M.
- Comprendere le cellule M può informare le strategie per la salute intestinale.
- Ulteriori ricerche potrebbero esplorare le implicazioni per le terapie immunitarie.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of bacterial transcytosis by M cells in Peyer’s patches addresses a critical gap in understanding mucosal immune surveillance and host-microbe interactions. This assay enables mechanistic de-risking of antigen uptake pathways, supporting predictive confidence in early immunology and microbiome-targeted discovery. The method’s ability to distinguish bacterial species transcytosed by M cells informs target validation and portfolio triage for mucosal immunomodulation strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of M cell-mediated antigen uptake mechanisms in a physiologically relevant system.
- Supports functional target validation for molecules modulating mucosal immune responses.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying the role of Gp2 and bacterial ligands in transcytosis.
- Provides predictive confidence for advancing immunomodulatory or microbiome-based candidates.
Screening & Assay Development
- Establishes a validated ex vivo platform for quantifying bacterial uptake by M cells using fluorescence and confocal microscopy.
- Enables reproducible measurement of transcytosis events across bacterial strains and experimental conditions.
- Supports assay standardization for downstream screening of modulators affecting M cell function or permeability.
- Facilitates reliable evaluation of candidate compounds targeting mucosal immune pathways.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for studying host-microbe interactions in the gut mucosa.
- Provides translational continuity from discovery to preclinical validation of mucosal immune targets.
- Enables risk-adjusted advancement decisions for immunotherapeutic and vaccine candidates targeting gut immunity.
- Supports identification of translational biomarkers linked to M cell-mediated antigen uptake.
Pipeline & Workflow Integration
This assay integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis testing of antigen uptake, supporting lead identification, and informing preclinical validation of mucosal immune modulators.
- Discovery Biology: Quantifies M cell-mediated transcytosis to clarify antigen uptake pathways and de-risk biological mechanisms.
- Screening: Provides standardized, quantitative readouts for comparing bacterial uptake across strains and interventions.
- Analytics: Delivers confocal imaging and fluorescence-based measurements to support statistical comparison of experimental groups.
- Translational Research: Bridges early discovery findings to preclinical models of gut immunity and host-microbe interaction.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for evaluating diverse bacterial species and candidate modulators in mucosal immunology workflows.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in mucosal immune target validation and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes bacterial uptake quantification and supports reproducibility across studies.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for immunomodulatory and microbiome-targeted programs, enhancing capital efficiency.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates targeting gut immune pathways.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgical techniques and confocal microscopy.
- Demands access to fluorescence labeling reagents and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and staining protocols.
- Adaptation may be needed for different bacterial species or model systems.
- Throughput is limited by surgical and imaging workflow constraints.
