Applicazione di un mouse legatura Patch Peyer Assay intestinale Loop per valutare assorbimento da parte delle cellule batteriche M

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare l'assorbimento batterico da parte delle cellule M situate all'interno del sistema immunitario della mucosa intestinale. Il primo passo di questa procedura consiste nell'esporre e legare le placche del dotto linfatico intestinale di un topo anestetizzato. Successivamente, vengono iniettati batteri fluorescenti nella zona legata.

Un'ora dopo, le aree di pire vengono escisse. Le cellule nel tessuto vengono quindi permeabilizzate e colorate per il marcatore delle cellule M, GP due. Infine, i campioni vengono osservati mediante microscopio confocale e i batteri in transcitosi attraverso le cellule M possono essere visualizzati.

Oltre a fornire informazioni sulla base molecolare della trascitosi batterica mediata da cellule M, il metodo può essere applicato ad altri sistemi. Ad esempio, questo protocollo potrebbe essere utilizzato per studiare la permeabilità cellulare e l'intestino in frammenti utilizzando cloro e microrganismi. Utilizzando un’ansa di vetro sterile, effettuare un’agitazione superficiale dei batteri fluorescenti su una piastra di agar LB e incubare la piastra a 37 gradi Celsius fino a quando non diventano visibili colonie singole. Scegliere una singola colonia dall’agar solido e usarla per inoculare due millilitri di terreno LB fresco.

Successivamente, coltivare i batteri in agitazione per tutta la notte a 37 gradi Celsius. Una volta che la coltura iniziale è cresciuta, trasferire 500 microlitri di batteri in 4,5 millilitri di terreno LB e incubare questa nuova coltura a 37 gradi Celsius per tre o quattro ore, oppure fino a quando la densità ottica a 600 nanometri raggiunge il valore di uno, indicando che la crescita batterica è in fase logaritmica. A questo punto, centrifugare la coltura a 3000 × g per cinque minuti a quattro gradi Celsius per raccogliere i batteri; dopo la centrifugazione, scartare il soprannatante e lavare il pellet con cinque millilitri di PBS sterile. Dopo aver ripetuto il lavaggio, risospendere i batteri in cinque millilitri di PBS.

Dopo aver posizionato il topo sotto anestesia continua con isoflurano, utilizzare strumenti sterili per aprire asetticamente l'addome del topo. Iniziare esponendo l'intestino tenue e individuare le placche di Peyer. Una volta trovate le placche di Peyer, utilizzare del filo chirurgico sterile per legare l'intestino a circa cinque millimetri da un lato della placca.

Prestare attenzione a non recidere i vasi sanguigni durante l'intervento. Una volta legato l'intestino, utilizzare una siringa per iniettare 50 microlitri di sospensione batterica pari a circa 10 alla settima UFC nel tratto intestinale legato a livello della placca di Peyer, dal lato libero dell'intestino. Successivamente, utilizzare del filo per legare l'altro lato dell'intestino.

Chiudere l'addome del topo con una clip e mantenere il topo sotto anestesia per un'ora prima di sopprimerlo. Per raccogliere la placca Peyer, asportare con attenzione la placca Peyer. Quindi lavare vigorosamente con PBS la sezione intestinale raccolta per diverse volte, al fine di pulire la superficie apicale della placca Peyer ed eliminare il fluido mucosale in eccesso e i batteri.

Dopo aver lavato la patch di PI, posizionarla in una pozzetta di una piastra a 24 pozzetti e aggiungere la soluzione cyto effects o cyto perm. Incubare il campione sul ghiaccio per un'ora. Una volta fissata la patch di P'S, immergerla in un millilitro di buffer perm wash per cinque minuti.

Ripetere questo passaggio di lavaggio tre volte. Quindi posizionare il campione in un millilitro di buffer bloccante e incubarlo sul ghiaccio per 30 minuti. Dopo il passaggio di bloccaggio, aggiungere l'anticorpo monoclonale anti topo GP2 a una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro e incubare il campione tutta la notte a quattro gradi Celsius per evidenziare le cellule M.

Successivamente, lavare il campione come in precedenza. Aggiungere un secondo anticorpo coniugato e incubare il campione sul ghiaccio al buio per due ore. Una volta colorato il campione, lavarlo delicatamente in PBS.

Quindi posizionare tre o quattro frammenti di vetrino coprioggetto circolari su un vetrino e immergere la placca di pires in 200 microlitri di una soluzione al 30% di glicerolo in PBS. Sul vetrino, utilizzare un microscopio confocale a laser DM IRE2 o un microscopio con tecnica di deconvoluzione Delta Vision per osservare il campione. In questa immagine, si può osservare che il *Salmonella typhimurium* marcato con GFP verde è circondato da GP2 mostrato in rosso sulla membrana plasmatica apicale.

In questa immagine ruotata, i batteri sono visibili all'interno delle vescicole citoplasmatiche subapicali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la trascitosi batterica da parte delle cellule M utilizzando il saggio intestinale ligato di Lu pys.