Applicazione di un mouse legatura Patch Peyer Assay intestinale Loop per valutare assorbimento da parte delle cellule batteriche M

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare l'assorbimento batterico da parte delle cellule M situate all'interno del sistema immunitario della mucosa intestinale. Il primo passo di questa procedura consiste nell'esporre e legare le macchie di pire intestinali di un topo anestetizzato. I batteri fluorescenti vengono quindi iniettati nell'area legata.

Un'ora dopo, le macchie di pire vengono asportate. Le cellule del tessuto vengono quindi permeate e colorate per il marcatore delle cellule M, GP due. Infine, i campioni vengono osservati utilizzando un microscopio confocale e i batteri sottoposti a transcitosi da parte delle cellule M possono essere visualizzati.

Oltre a fornire informazioni sulle basi molecolari della transcitosi batterica da parte delle cellule m, il rifiuto può essere applicato ad altri sistemi. Ad esempio, questo protocollo potrebbe essere utilizzato per favorire la permeabilità cellulare e nell'intestino incorniciato utilizzando cloro e microbi Utilizzando uno spargitore di vetro sterile, striare i batteri fluorescenti su una piastra a coclea LB e incubare la piastra a 37 gradi Celsius fino a quando non sono visibili singole colonie. Prelevare una singola colonia dalla coclea solida e inocularela in due millilitri di terreno LB fresco.

Quindi coltivare i batteri su uno shaker durante la notte a 37 gradi Celsius. Una volta che la coltura starter è cresciuta, trasferire 500 microlitri di batteri in 4,5 millilitri di terreno LB e incubare questa nuova coltura a 37 gradi Celsius per tre o quattro ore o fino a quando la sua densità ottica a 600 nanometri raggiunge uno, indicando che la crescita batterica è in fase logaritmica. A questo punto, centrifugare la coltura a 3000 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per raccogliere i batteri dopo la centrifugazione, scartare la trappola e lavare il pellet con cinque millilitri di PBS sterile Dopo aver ripetuto la fase di lavaggio Resus sospendere i batteri in cinque millilitri di PBS.

Dopo aver posto il topo in anestesia continua con fluoro, utilizzare strumenti sterili per aprire asetticamente l'addome del topo. Inizia esponendo l'intestino tenue e individua le chiazze del PI. Una volta trovati i cerotti di un PI, utilizzare un filo da cucito sterile per legare l'intestino a circa cinque millimetri da un lato del cerotto.

Fare attenzione a evitare di recidere i vasi sanguigni durante la procedura. Una volta legato l'intestino, utilizzare una siringa per iniettare 50 microlitri di sospensione batterica a circa 10-7 CFU nell'anello del cerotto delle pire legate sul lato libero dell'intestino. Quindi usa il filo per legare l'altro lato dell'intestino.

Chiudere l'addome del topo con una clip e mantenere il topo sotto anestesia per un'ora prima di sopprimerlo. Per raccogliere il cerotto di pire, asportare con cura il cerotto di pire. Quindi sciacquare energicamente il PBS attraverso la sezione raccolta dell'intestino più volte per lavare il lato apicale del cerotto del PI e rimuovere il liquido mucoso e i batteri in eccesso.

Una volta lavato il cerotto del PI, posizionarlo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e aggiungere gli effetti cyto o la soluzione di permanente cyto. Incubare il campione su ghiaccio per un'ora. Una volta fissato il cerotto P'S, immergerlo in un millilitro di tampone per il lavaggio permanente per cinque minuti.

Ripetere questa fase di lavaggio tre volte. Quindi posizionare il campione in un millilitro di tampone bloccante e incubarlo su ghiaccio per 30 minuti. Dopo la fase di blocco, aggiungere l'anticorpo monoclonale anti topo GP two a una concentrazione finale di cinque microgrammi per millilitro e incubare il campione per una notte a quattro gradi Celsius per colorare le cellule M.

Quindi, lavare il campione come prima. Aggiungere un pavimento secondario per l'anticorpo coniugato e incubare il campione su ghiaccio al buio per due ore. Una volta che il campione è colorato, lavarlo delicatamente con PBS.

Quindi posizionare tre o quattro pezzi di vetro di copertura circolare su un vetrino e incorporare il cerotto pires in 200 microlitri di una soluzione di glicerolo al 30% in PBS. Sul vetrino, utilizzare un microscopio laser confocale DM IRE a due o un microscopio a deconvoluzione per il ripristino della visione Delta per osservare il campione. In questa immagine, si può vedere la salmonella typhimurium verde marcata con GFP circondata da GP due mostrata in rosso sulla membrana plasmatica apicale.

In questa immagine ruotata, i batteri sono visibili all'interno delle vescicole citoplasmatiche subapicali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la transcitosi batterica da parte delle cellule M utilizzando il saggio Lu intestinale pys legato.