Biosensori per il rilevamento di antibiotici batteri di stafilococco resistenti

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di discriminare ceppi di stafilococco aureo resistenti alla meticillina o MRSA e sensibili alla meticillina, o MSSA, da parte di batteri antilitici appositamente selezionati. Quando i batteri sono attaccati alle lunghe code flessibili del fago litico, la distanza tra le cellule attaccate e la superficie del sensore è maggiore della penetrazione dell'onda acustica del QC m. Pertanto, il segnale dell'evento di associazione non viene generato.

La sostituzione del fago intatto con lo sferoide si traduce in un fago completamente funzionale con code corte, che legano i batteri entro la profondità di penetrazione dell'onda acustica del QC m, contribuendo quindi ai cambiamenti di frequenza e dissipazione quando gli steroidi del fago vengono depositati sul cristallo A-Q-C-M-D ed esposti alla sospensione batterica mista, legano entrambi i ceppi MRSA e MSSA di stafilococco aureo, Ma non altri batteri che separano lo Staphylococcus aureus dagli altri batteri sulla superficie del cristallo. Infine, quando vengono aggiunte due perle legate all'anticorpo A specifiche per PPP Mr.RSA, viene generato un segnale in presenza di ceppi di stafilococco aureo Mr.RSA. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto al metodo esistente come la PCR sono che questo metodo non richiede l'estrazione del DNA e non è sensibile agli empirici.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sullo screening e la disinfezione dello stafilococco orus, può essere applicato anche ad altri batteri resistenti agli antibiotici. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la fabbricazione di biosensori richiede precisione, accuratezza e pazienza. Inizia pulendo i pezzi di quarzo codificati in oro mediante incisione al plasma in Argonne per 10 minuti, quindi sterilizza i pezzi per sei ore sotto luce UV in un armadio sterile dopo la sterilizzazione a 50 microlitri di sospensione fagica sulla superficie d'oro di ciascun pezzo in una capsula di Petri sterile, quindi incuba i pezzi durante la notte in una camera umida a temperatura ambiente la mattina successiva, rimuovere la sospensione di fago rimanente per il tittering, quindi lavare ogni pezzo di quarzo con il fago legato cinque volte con PBS per rimuovere qualsiasi fago non legato.

Per testare l'infettività del fago immobilizzato su una superficie asciutta, stendere prima una coltura notturna di staphylococcus aureus su un eRate NZY e lasciare asciugare la sospensione. Quindi posiziona un pezzo di quarzo rivestito d'oro con il fago immobilizzato a faccia in giù sulla piastra. Dopo 12 ore a 37 gradi Celsius, si può osservare una zona di lisi che indica infettività per testare l'attività litica del fago libero in liquido.

Innanzitutto, aggiungere una coltura batterica notturna di staphylococcus aureus a 10 millilitri di NZY in ciascuna delle quattro fiasche da 300 millilitri. Quindi aggiungere due volte 10 ai sei PFU per millilitro di fago libero a due delle fiasche. Ora, monitora l'andamento temporale della lisi cellulare dello stafilococco per 570 minuti mediante misurazione della densità ottica a intervalli di 30 minuti per ogni pallone, effettuando una misurazione finale a 24 ore.

Per testare l'attività litica del fago legato in un liquido, ripetere i passaggi appena dimostrati, ma aggiungere pezzi d'oro con fago legato alle fiasche sperimentali invece del fago libero. Per preparare gli steroidi fagi, combinare prima 400 microlitri di sospensione stock di fago 1 2600 con un volume uguale di cloroformio di grado fotometrico spettrale in una fiala da un millilitro a temperatura ambiente. Quindi, agitare delicatamente la sospensione di cloroformio fagico da cinque a sei volte a intervalli di cinque secondi per una durata di un minuto.

Dopo aver lasciato stabilizzare la sospensione per 30 secondi, raccogliere la frazione superiore contenente la sospensione steroidea. Trasferire alcuni microlitri della sospensione steroidea in una fiala da 500 microlitri per la trasmissione e la microscopia elettronica a scansione. Conservare la sospensione steroidea rimanente in una fiala da un millilitro per la produzione di biosensori.

Per preparare prima il biosensore, pulire i sensori QCMD mediante incisione al plasma in argon per 10 minuti in un pulitore al plasma. Quindi sciacquare i sensori con esano per rimuovere eventuali impurità organiche. Successivamente, pulire un trogolo dell'equilibrio del film come precedentemente descritto da Olson Etal nel Journal of Microbiological methods.

Riempiendo una vasca LB con una soluzione sottofase e pulendola con una barriera a trogolo. Quindi stabilizzare la depressione a 20 gradi Celsius per 10 minuti. Ora crea un monostrato di fagi sulla soluzione di sottofase LB gocciolando accuratamente un Eloqua da 300 microlitri di sospensione acquosa di fago 1 2600 con un'asta di vetro commestibile inclinata che è parzialmente immersa nella fase SOPH Dopo aver lasciato stabilizzare il monostrato per 10 minuti, comprimere il monostrato a una velocità di 30 millimetri al minuto fino a raggiungere una pressione costante di 19 newton per metro.

La deposizione verticale del film è la parte più complicata di questa procedura. Per garantire il successo, è necessario assicurarsi che tutti i componenti di questa procedura siano puliti e che anche i parametri di deposizione monostrato siano ottimizzati. Ora immergi il sensore dentro e fuori dal monostrato sette volte di seguito a una velocità di 4,5 millimetri al minuto per eseguire una deposizione verticale della pellicola.

Sul sensore QCMD posizionato perpendicolarmente. La deposizione verticale del film lega il fago intatto alla superficie del biosensore. Infine, utilizzare biosensori fagici fabbricati per la microscopia elettronica di rilevamento MRSA e l'optometria sia del fago libero che di quello legato.

Inizia questo passaggio stabilendo le linee di base, la frequenza di risonanza e la dissipazione di energia del sensore QCM in acqua utilizzando il software qof T. Dopo circa 30 minuti, aspirare una sospensione di cellule batteriche vive sensibili alla meticillina sensibile o MSSA in acqua attraverso la cella di prova. La linea blu mostra il valore della frequenza mentre la linea rossa mostra il livello di dissipazione dell'energia.

Le linee orizzontali mostrano l'istituzione della linea di base. Il numero due al centro dello schermo indica che gli eventi sono correlati al sensore. Il numero due su quattro monitora continuamente le variazioni della frequenza di risonanza e della dissipazione di energia dei sensori per il primo armonico mostrato.

Ecco i cambiamenti dopo che i batteri hanno superato la cella di prova. Si noti che bastano pochi secondi perché la frequenza diminuisca e la dissipazione di energia aumenti quando le variazioni della frequenza di risonanza dei sensori e della dissipazione di energia interna raggiungono livelli di saturazione alla sospensione di anticorpi PVP in lattice coniugato al flusso e continuano il monitoraggio continuo della dissipazione di frequenza. Qui viene mostrato l'intero processo di rilevamento che mostra la definizione delle linee di base, il cambiamento di pochi secondi nella frequenza e nella dissipazione di energia dopo l'aggiunta di batteri, la saturazione e, infine, i cambiamenti dopo l'aggiunta di perline.

Questa tabella mostra l'attività litica fagica dimostrata contro tutti i ceppi testati di S reus, compresi i ceppi di MRSA come indicato dal test spot dei fagi. Le dimensioni della placca variavano generalmente da cinque a 15 millimetri. Non è stata riscontrata alcuna attività contro altre colture di test.

Qui, la normale crescita dello stafilococco Urus A TCC 1 2600 in mezzo NZ Y su un incubatore shaker a 37 gradi Celsius è dimostrata con il numero di batteri che aumenta da 3,2 volte 10 a sei a 4,0 volte 10 a otto CFU per millilitro. In circa 24 ore, il fago immobilizzato su una superficie d'oro ha dimostrato un'attività litica simile all'attività del fago in sospensione. Il fago immobilizzato è rimasto infettivo in una nuova infezione batterica anche dopo l'uso in un esperimento di coltivazione di 24 ore, diversi lavaggi e conservazione in PBS per sei giorni a quattro gradi Celsius.

In questa immagine, si può osservare il lisosoma attorno al pezzo d'oro, indicando che i fagi immobilizzati sono in grado di lisare le cellule batteriche. Pertanto, come illustrato qui, l'effettiva diminuzione della crescita batterica riscontrata nella co-coltura di batteri e fago smobilitato è il risultato dell'interazione primaria tra batteri sospesi in acqua e fago legato. Qui, le micrografie elettroniche a trasmissione e a scansione del fago litico intatto 1 2600 su una superficie di substrato d'oro sono mostrate quando la sospensione del fago è sottoposta a trattamento con cloroformio, la coda del fago si contrae in lunghezza e si ispessisce e la testa poligonale diventa arrotondata o steroidea.

Nonostante i significativi cambiamenti strutturali. L'attività litica dello steroide, misurata dal numero di placche, non è cambiata a seguito del trattamento con cloroformio. I sensori QCM con fagi litici immobilizzati non hanno mostrato cambiamenti significativi nella frequenza di risonanza o nella dissipazione di energia quando sono stati esposti a MRSA, indicando che l'interazione tra i fagi MRSA ha comportato un cambiamento di massa nominale.

Secondo il QCM, tuttavia, le micrografie elettroniche dei biosensori post-saggio hanno rivelato un significativo legame batterico sulla superficie del sensore. Quando le sospensioni di MRSA sono state iniettate nella cella a flusso con biosensori di steroidi fagici, è stata osservata una sostanziale diminuzione della frequenza e un aumento della dissipazione. A seguito delle interazioni di legame con l'MRSA batterico del fago sfero, i sensori del saggio sono stati esposti a sospensioni di velocità in lattice coniugato con due anticorpi BBP.

Questi biosensori per il dosaggio dell'MRSA hanno risposto alle sospensioni di velocità in lattice coniugato con due anticorpi A BPP poiché sono stati osservati un'ulteriore diminuzione della frequenza e un aumento della dissipazione. Il legame dell'MSA alle sonde fagiche e alle velocità del lattice coniugato con due anticorpi A PPP è stato confermato mediante indagini di microscopia elettronica a scansione. Quando il biosensore di steroidi fagici è stato esposto a MSSA, sono stati osservati una sostanziale diminuzione della frequenza e un aumento della dissipazione a seguito di interazioni di legame tra steroidi fagi e MSSA, i sensori del saggio sono stati messi alla prova con sospensioni di velocità in lattice coniugato con due anticorpi A PPP.

Inizialmente, il biosensore del saggio MSSA ha mostrato una breve transitorietà degli aumenti di frequenza e delle diminuzioni della dissipazione dopo pochi minuti di MSSA e PPP due anticorpi A coniugati in lattice che accelerano le interazioni. Tuttavia, la frequenza ritorna ai livelli di introduzione di due anticorpi A dopo PVP, ma l'energia deci è aumentata. Il legame di MSSA alle sonde dei fagi è stato quindi analizzato mediante microscopia elettronica a scansione, ma non è stato osservato alcun legame tra MSSA e PPP due velocità di lattice coniugato con anticorpi A, un profilo di spessore simmetrico delle ellipi e una mappa di spessore 3D del fago litico.

È stata tracciata una linea attraverso la mappa dello spessore per generare il profilo dello spessore. Queste ultime immagini mostrano immagini rappresentative della telecamera ottica CCD di MRSA catturate dai fagi legati alla superficie d'oro del sensore A-Q-C-M-D e profili di intensità 3D di MRSA su substrati di vetro immobilizzati dai fagi a una concentrazione di 10 per otto CFU per millilitro e 10 per nove CFU per millilitro. Ogni cerchio rotondo rappresenta un singolo batterio.

È chiaro che l'aumento della concentrazione di batteri in sospensione liquida da 10 a 8 CFU per millilitro a 10-9 CFU per millilitro determina un aumento significativo dei batteri catturati nei profili di intensità 3D. Il numero di picchi bianchi sullo strato superiore è proporzionale al numero di batteri catturati e, come previsto, la densità dei picchi aumenta significativamente quando l'esposizione batterica viene aumentata da 10 a otto a 10 a nove CFU per millilitro. Lo strato inferiore blu scuro corrisponde allo strato di fagi che entra in contatto con un substrato d'oro.

Man mano che vengono catturati più batteri, le proprietà ottiche dei fagi cambiano mentre legano i batteri, risultando in un colore blu più scuro e intenso. Seguendo questa procedura, possiamo definire l'efficienza di cattura batterica al fine di comprendere le interazioni tra i batteri fagi dopo lo sviluppo. Questa tecnica mostra ai ricercatori nel campo della terapia batterica fagica la strada per esplorare l'inibizione dei patogeni negli animali e negli esseri umani Non dimenticare che lavorare con solventi organici nei batteri patogeni può essere estremamente pericoloso e seguire la rigida regolamentazione è molto importante.