Biosensori per il rilevamento di antibiotici batteri di stafilococco resistenti

L'obiettivo generale del seguente esperimento è discriminare ceppi di staphylococcus aureus resistenti alla meticillina (MRSA) e ceppi sensibili alla meticillina (MSSA) mediante un batteriofago litico anti-modificato appositamente selezionato. Quando i batteri si legano alle lunghe code flessibili del fago litico, la distanza tra le cellule legate e la superficie del sensore risulta maggiore rispetto alla penetrazione dell'onda acustica del QC m. Di conseguenza, non viene generato alcun segnale dell'evento di legame.

Sostituendo il fago integro con lo sferoide si ottengono fagi completamente funzionali con code corte, che si legano ai batteri entro la profondità di penetrazione dell'onda acustica del cristallo QCM. Ciò contribuisce ai cambiamenti di frequenza e dissipazione quando i derivati steroidei del fago vengono depositati sul cristallo A-Q-C-M-D ed esposti a una sospensione batterica mista: essi si legano sia ai ceppi MRSA che MSSA di Staphylococcus aureus, ma non ad altri batteri, separando così Staphylococcus aureus dagli altri batteri sulla superficie del cristallo. Infine, quando vengono aggiunte le microsfere legate all'anticorpo specifico PPP2A per MRSA, si genera un segnale in presenza di ceppi MRSA di Staphylococcus aureus. I principali vantaggi di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la PCR, sono che questo metodo non richiede l'estrazione del DNA e non è sensibile agli interferenti.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni utili per lo screening e la disinfezione di Staphylococcus orus, può essere applicato anche ad altri batteri resistenti agli antibiotici. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la fabbricazione di biosensori richiede precisione, accuratezza e pazienza. Iniziare pulendo i pezzi di quarzo con codifica in oro mediante incisione al plasma in Argonne per 10 minuti, quindi sterilizzare i pezzi per sei ore sotto luce UV in un armadio sterile; dopo la sterilizzazione, aggiungere 50 microlitri di sospensione di fagi al substrato in oro di ciascun pezzo in una piastra di Petri sterile, quindi incubare i pezzi tutta la notte in una camera umida a temperatura ambiente. La mattina successiva, rimuovere la sospensione di fagi residua per la titolazione, quindi lavare ogni pezzo di quarzo con fagi legati cinque volte con PBS per rimuovere qualsiasi fago non legato.

Per verificare l'infettività del fago immobilizzato su una superficie secca, stendere innanzitutto una coltura notturna di Staphylococcus aureus su un terreno NZY e lasciare asciugare la sospensione. Successivamente, posizionare al contrario un pezzo di quarzo rivestito d'oro con fago immobilizzato sulla piastra. Dopo 12 ore a 37 gradi Celsius, si può osservare una zona di lisi, indicativa di infettività, per verificare l'attività litica del fago libero in soluzione.

Prima di tutto, aggiungere una coltura batterica notturna di Staphylococcus aureus a 10 millilitri di NZY in ognuno di quattro flaconi con attacco laterale da 300 millilitri. Successivamente, aggiungere due volte 10 alla sesta PFU per millilitro di fago libero a due dei flaconi. Ora, monitorare l'andamento della lisi delle cellule di Staphylococcus per 570 minuti mediante misurazioni della densità ottica a intervalli di 30 minuti per ciascun flacone, effettuando una misurazione finale a 24 ore.

Per verificare l'attività litica del fago legato in soluzione, ripetere i passaggi appena illustrati, ma aggiungere nei flaconi sperimentali frammenti d'oro con fago legato invece del fago libero. Per preparare i derivati steroidei del fago, mescolare innanzitutto 400 microlitri di sospensione del ceppo di fago 1 2600 con un volume uguale di cloroformio di grado spettrofotometrico in un vial da un millilitro a temperatura ambiente. Successivamente, vortexare delicatamente la sospensione di fago e cloroformio da cinque a sei volte a intervalli di cinque secondi nell'arco di un minuto.

Dopo aver lasciato stabilizzare la sospensione per 30 secondi, raccogliere la frazione superiore contenente la sospensione di steroidi. Trasferire alcune microlitro della sospensione di steroidi in un vial da 500 microlitro per la microscopia elettronica a trasmissione e a scansione. Conservare la sospensione di steroidi rimanente in un vial da un millilitro per la produzione di biosensori.

Per preparare prima il biosensore, pulire i sensori QCMD mediante incisione al plasma in argon per 10 minuti in un pulitore al plasma. Successivamente, risciacquare i sensori con esano per rimuovere eventuali impurezze organiche. Poi, pulire una vaschetta dell'equilibrio pellicolare come precedentemente descritto da Olson et al. nel Journal of Microbiological Methods.

Riempendo una vasca LB con una soluzione sottostante e pulendola con una barriera per vasca. Successivamente, stabilizzare la vasca a 20 gradi Celsius per 10 minuti. Creare ora un monolayer di fago sulla soluzione sottostante LB lasciando cadere con attenzione 300 microlitri di sospensione acquosa di fago 1 2600 mediante una bacchetta di vetro inclinata parzialmente immersa nella fase SOPH. Dopo aver lasciato stabilizzare il monolayer per 10 minuti, comprimere il monolayer a una velocità di 30 millimetri al minuto fino al raggiungimento di una pressione costante di 19 newton per metro.

La deposizione del film verticale è la parte più delicata di questa procedura. Per garantire il successo, è necessario assicurarsi che tutti i componenti della procedura siano puliti e che i parametri di deposizione del monoscopio siano ottimizzati. A questo punto, immergere estrarre ripetutamente il sensore nella soluzione del monoscopio per sette volte consecutive, a una velocità di 4,5 millimetri al minuto, per effettuare la deposizione del film verticale.

Sul sensore QCMD posizionato perpendicolarmente. Il deposito verticale del film lega il fago integro alla superficie del biosensore. Infine, utilizzare i biosensori a base di fago realizzati per la rilevazione di MRSA mediante microscopia elettronica e l'optometria sia del fago libero che di quello legato.

Iniziare questo passaggio stabilendo i valori di base, la frequenza di risonanza e la dissipazione dell'energia del sensore QCM in acqua utilizzando il software qof T. Dopo circa 30 minuti, far passare attraverso la cella di prova una sospensione di cellule batteriche vive di Staphylococcus aureus sensibile alla meticillina o MSSA in acqua. La linea blu mostra il valore di frequenza, mentre la linea rossa indica il livello di dissipazione dell'energia.

Le linee orizzontali mostrano l'instaurazione della linea di base. Il numero due al centro dello schermo indica che gli eventi sono relativi al sensore. Il numero due su quattro monitora continuamente le variazioni della frequenza di risonanza e della dissipazione energetica dei sensori per l'armonica superiore mostrata.

Ecco i cambiamenti dopo che i batteri hanno superato la cella di prova. Si noti che occorrono solo pochi secondi affinché la frequenza diminuisca e la dissipazione dell'energia aumenti, quando i cambiamenti nella frequenza di risonanza del sensore e nella dissipazione dell'energia interna raggiungono i livelli di saturazione alla sospensione dell'afflusso di latex coniugato con anticorpi PVP e proseguono il monitoraggio continuo della dissipazione della frequenza. Qui viene mostrato l'intero processo di rilevamento, che illustra l'instaurazione delle linee di base, il rapido cambiamento di pochi secondi nella frequenza e nella dissipazione dell'energia dopo l'aggiunta dei batteri, la saturazione e, infine, i cambiamenti successivi all'aggiunta delle microsfere.

Questa tabella mostra l'attività litica del fago dimostrata contro tutti i ceppi di S. aureus testati, inclusi i ceppi MRSA, come indicato dal test di spot con fago. Le dimensioni delle placche sono generalmente comprese tra cinque e quindici millimetri. Non è stata riscontrata alcuna attività contro altre colture di prova.

Qui viene mostrata la crescita normale di Staphylococcus Urus A TCC 1 2600 in mezzo NZ Y in un incubatore agitatore a 37 gradi Celsius, con il numero di batteri che aumenta da 3,2 × 10⁶ a 4,0 × 10⁸ UFC per millilitro. In circa 24 ore, il fago immobilizzato su una superficie d'oro ha dimostrato un'attività litica simile a quella del fago in sospensione. Il fago immobilizzato è rimasto infettivo in una nuova infezione batterica anche dopo essere stato utilizzato in un esperimento di crescita di 24 ore, diversi lavaggi e conservazione in PBS per sei giorni a quattro gradi Celsius.

In questa immagine, si può osservare il lisosoma attorno al frammento d'oro, indicando che i fagi immobilizzati sono in grado di lisare le cellule batteriche. Pertanto, come illustrato qui, la riduzione efficace della crescita batterica osservata nella co-coltura di batteri e fagi demobilizzati è il risultato dell'interazione primaria tra batteri sospesi in acqua e fagi legati. Qui vengono mostrate micrografie elettroniche a trasmissione e a scansione del fago litico intatto 1 2600 su una superficie di substrato d'oro; quando la sospensione di fagi è sottoposta a trattamento con cloroformio, la coda del fago si accorcia, si ispessisce e la testa poligonale diventa arrotondata o di forma steroidale.

Nonostante i notevoli cambiamenti strutturali, l'attività litica del corticosteroide, misurata in base al numero di placche, non è variata a seguito del trattamento con cloroformio. I sensori QCM con fagi litici immobilizzati non hanno mostrato cambiamenti significativi nella frequenza di risonanza né nella dissipazione dell'energia quando esposti a MRSA, indicando che l'interazione tra fagi e MRSA non ha determinato una variazione di massa.

Secondo il QCM, tuttavia, le microfotografie elettroniche dei biosensori dopo il saggio hanno rivelato un significativo legame batterico sulla superficie del sensore. Quando sospensioni di MRSA sono state iniettate nella cella a flusso con biosensori a fago steroidi, si è osservata una sostanziale diminuzione della frequenza e un aumento della dissipazione. Dopo le interazioni di legame batterico MRSA mediato da fago sphero, i sensori del saggio sono stati esposti a sospensioni di lattex con anticorpo BBP two A coniugato.

Questi biosensori per saggio MRSA hanno risposto alle sospensioni di lattesina coniugate con l'anticorpo BPP due A, mostrando un'ulteriore diminuzione della frequenza e un aumento della dissipazione. Il legame dell'MSA alle sonde fagiche e alle lattesine coniugate con l'anticorpo PPP due A è stato confermato mediante indagini di microscopia elettronica a scansione. Quando il biosensore fagico steroideo è stato esposto all'MSSA, si è osservata una diminuzione sostanziale della frequenza e un aumento della dissipazione in seguito alle interazioni di legame tra il fago steroideo e l'MSSA; successivamente, i sensori di saggio sono stati sottoposti alle sospensioni di lattesina coniugate con l'anticorpo PPP due A.

Inizialmente, il biosensore del saggio MSSA ha mostrato un breve transitorio di aumenti di frequenza e diminuzioni di dissipazione dopo alcuni minuti di interazioni tra MSSA e velocità di lattice coniugate con l'anticorpo PPP due A. Tuttavia, la frequenza è tornata ai livelli registrati dopo l'introduzione dell'anticorpo PVP due A, ma l'energia deci è aumentata. Il legame di MSSA alle sonde fagiche è stato quindi analizzato mediante microscopia elettronica a scansione, ma in questo caso nessun legame tra MSSA e velocità di lattice coniugate con l'anticorpo PPP due A è stato osservato; qui vengono mostrati un profilo di spessore ellissimmetrico e una mappa tridimensionale dello spessore del fago litico.

È stata tracciata una linea sulla mappa dello spessore per generare il profilo di spessore. Queste ultime immagini mostrano immagini rappresentative di una telecamera ottica CCD di MRSA catturati da fagi legati alla superficie d'oro del sensore A-Q-C-M-D e profili di intensità 3D di MRSA su substrati di vetro con fagi immobilizzati, a una concentrazione di 10 alla ottava UFC per millilitro e 10 alla nona UFC per millilitro. Ogni cerchio rotondo rappresenta un singolo batterio.

È evidente che l'aumento della concentrazione batterica in sospensione liquida da 10⁸ UFC per millilitro a 10⁹ UFC per millilitro determina un incremento significativo dei batteri catturati nei profili di intensità 3D. Il numero di picchi bianchi nel livello superiore è proporzionale al numero di batteri catturati e, come previsto, la densità dei picchi aumenta notevolmente quando l'esposizione batterica passa da 10⁸ a 10⁹ UFC per millilitro. Il livello inferiore di colore blu scuro corrisponde allo strato di fagi che entra in contatto con un substrato d'oro.

Man mano che vengono catturati più batteri, le proprietà ottiche del fago cambiano man mano che si legano ai batteri, producendo un colore blu più scuro e intenso. Seguendo questa procedura, possiamo definire l'efficienza di cattura batterica al fine di comprendere le interazioni tra fago e batteri dopo lo sviluppo. Questa tecnica indica la strada ai ricercatori nel campo della terapia batterica con fagi per esplorare l'inibizione dei patogeni negli animali e negli esseri umani. Non dimenticare che lavorare con solventi organici in presenza di batteri patogeni può essere estremamente pericoloso, ed è molto importante seguire le normative rigorose.