Test rapidi di sensibilità antimicrobica mediante imaging Raman scattering stimolato dell'incorporazione del deuterio in un singolo batterio

Il test rapido di sensibilità antimicrobica può essere ottenuto entro 2,5 ore nelle urine e nel sangue, che è considerato un'enorme riduzione del tempo di analisi rispetto al metodo convenzionale di microdiluizione del brodo. Può monitorare l'attività metabolica batterica in un ambiente complesso, come il sangue intero. Per iniziare, controlla la concentrazione batterica dei campioni misurando la densità ottica con un fotometro a 600 nanometri di lunghezza d'onda.

Per raggiungere una concentrazione cellulare finale di otto volte 10 alla quinta Colony Forming Units, o CFU, per millilitro, diluire la soluzione batterica utilizzando il normale mezzo MHB senza deuterio. Dopo aver miscelato le cellule batteriche per vortice, rimuovere 300 aliquote da microlitri della soluzione batterica in sette microtubi da 1,5 millilitri e un'aliquota da 600 microlitri della soluzione batterica in un microtubo da 1,5 millilitri. Quindi aggiungere 4,8 microlitri della soluzione madre antibiotica nel microtubo contenente 600 microlitri della soluzione batterica per ottenere la concentrazione finale di antibiotico di otto microgrammi per millilitro.

Aggiungere 300 microlitri della soluzione batterica con antibiotico a un'aliquota di 300 microlitri della soluzione batterica senza antibiotico per ottenere una soluzione diluita doppia con la concentrazione finale di antibiotico di quattro microgrammi per millilitro. Ripetere la doppia diluizione seriale degli antibiotici in esame fino a raggiungere la concentrazione minima di 0,25 microgrammi per millilitro. Scartare 300 microlitri della soluzione dall'ultimo microtubo.

Assegnare un tubo senza antibiotici al controllo positivo con trattamento con deuterio e al controllo negativo senza deuterio. Incubare l'aliquota batterica con l'antibiotico contenente terreno MHB per un'ora. Nel frattempo, preparare una diluizione seriale di antibiotici con mezzo MHB contenente deuterio al 100% con gli stessi gradienti di concentrazione descritti in precedenza.

Dopo un'ora di incubazione, aggiungere 700 microlitri di antibiotico diluito in serie con mezzo MHB contenente deuterio al 100% ai 300 microlitri di batteri antibiotici pretrattati nella stessa concentrazione di antibiotici. Omogeneizzare la miscela pipettando su e giù più volte. Aggiungere 700 microlitri di mezzo MHB contenente deuterio al 100% senza antibiotici a 300 microlitri di batteri privi di antibiotici come controllo positivo.

Aggiungere 700 microlitri di mezzo MHB contenente deuterio 0% senza antibiotici a 300 microlitri di batteri privi di antibiotici come controllo negativo. Incubare tutti i microtubi a 37 gradi Celsius e 200 rotazioni al minuto per 30 minuti. Dopo l'incubazione, centrifugare il millilitro di campione batterico trattato con antibiotico e deuterio a 6.200 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi lavare il pellet due volte con acqua purificata. Fissare i campioni in una soluzione di formalina al 10% volume per volume e conservarli a quattro gradi Celsius. Controllare la concentrazione di Escherichia coli dal campione batterico appena preparato misurando la densità ottica con un fotometro a lunghezza d'onda di 600 nanometri.

Per imitare i campioni clinici di infezione del tratto urinario, aumentare il campione di Escherichia coli in 10 millilitri di campioni di urina de-identificati per raggiungere una concentrazione finale di 10 ai sei CFU per millilitro. Filtrare l'urina a spillo di Escherichia coli utilizzando un filtro da cinque micron e dividere la soluzione batterica filtrata in aliquote da 300 microlitri in sette microtubi da 1,5 millilitri e un'aliquota da 600 microlitri in un microtubo da 1,5 millilitri. Eseguire il trattamento di incorporazione del deuterio in presenza di antibiotici come descritto in precedenza.

Per imitare i campioni clinici di infezione del flusso sanguigno, spike Pseudomonas aeruginosa in un millilitro di sangue umano de-identificato per raggiungere una concentrazione finale di 10 al sesto CFU per millilitro. Per lisare il sangue, aggiungere nove millilitri di acqua purificata sterile. Filtrare il sangue a spillo di Pseudomonas aeruginosa usando un filtro da cinque micron.

Quindi raccogliere i batteri dal campione filtrato a un volume di un millilitro mediante centrifugazione a 6.200 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, dividere la soluzione di sangue a spillo di Pseudomonas aeruginosa in aliquote da 300 microlitri in sette microtubi da 1,5 millilitri e un'aliquota da 600 microlitri della soluzione batterica in un microtubo da 1,5 millilitri ed eseguire il trattamento di incorporazione del deuterio in presenza di antibiotici come descritto in precedenza. Per la preparazione del campione, lavare un millilitro di soluzione batterica fissa con acqua purificata e centrifugare la soluzione batterica lavata a 6.200 volte g per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Rimuovere il surnatante e arricchire la soluzione batterica a circa 20 microlitri con acqua sterilizzata. Depositare la soluzione batterica su un vetro di copertura rivestito di poli-L-lisina, sandwich con un altro vetro di copertura e sigillare il campione. Nel microscopio SRS, un laser a femtosecondi sintonizzabile con una frequenza di ripetizione di 80 megahertz fornisce la pompa e i laser di eccitazione di Stokes.

Il fascio di Stokes è modulato da un modulatore acusto-ottico a 2,4 megahertz. Le due travi sono collinearmente combinate attraverso uno specchio dicroico. Quindi la pompa e i raggi Stokes vengono indirizzati in un microscopio a scansione laser costruito in laboratorio con uno specchio Galvo 2D per la scansione laser.

Un obiettivo ad acqua 60x focalizza i laser sul campione e un condensatore di olio raccoglie il segnale dal campione. Due filtri vengono utilizzati per filtrare il fascio di Stokes, mentre il fascio della pompa viene rilevato da un fotodiodo, dopo di che il segnale Raman stimolato viene estratto da un amplificatore lock-in. Utilizzando il software di controllo, inserire e sintonizzare la lunghezza d'onda della pompa a 852 nanometri.

Regolare la frequenza vibrazionale da C a D su 2.168 numero d'onda per visualizzare i batteri utilizzando un microscopio SRS. Misurare la potenza del laser utilizzando un misuratore di potenza. Impostare la potenza del laser a pompa sul campione su otto milliwatt e la potenza del laser Stokes sul campione su 50 milliwatt regolando la piastra a mezza onda davanti all'uscita laser.

Posizionare il campione standard DMSO d6 sullo stadio di campionamento e utilizzare un obiettivo di immersione in acqua 60x per focalizzare la pompa e i laser Stokes sul campione. Regolando le viti degli specchi riflettenti, allineare spazialmente la pompa e i raggi Stokes e dirigere i due raggi in un microscopio verticale dotato di sistema a specchio Galvo 2D per la scansione laser. Nel pannello di controllo del software, impostare ogni immagine SRS in modo che contenga 200 x 200 pixel e il tempo di permanenza dei pixel a 30 microsecondi.

Il tempo totale di acquisizione per un'immagine è di circa 1,2 secondi. Impostare la dimensione del passo su 150 nanometri, quindi la dimensione dell'immagine è di circa 30 per 30 micrometri quadrati. Dopo aver ottimizzato il sistema, estrarre il campione standard e posizionare il campione batterico sullo stadio del campione sotto l'obiettivo di immersione in acqua 60x.

Avviare l'imaging SRS di campioni batterici. Immagine di almeno tre campi visivi per ogni campione. L'effetto del tempo di incubazione sull'incorporazione del deuterio è misurato mediante microspettroscopia Raman spontanea nelle regioni CD e CH.

Il grafico del rapporto di intensità CD su CH sul tempo di incubazione del deuterio per singoli batteri ha mostrato un aumento dell'intensità di CD su CH sul tempo di incubazione da zero a 180 minuti. L'imaging SRS di Pseudomonas aeruginosa è stato condotto dopo incubazione con gentamicina e deuterio al 70%. L'ulteriore analisi statistica quantitativa ha mostrato che i segnali CD dei batteri erano significativamente più bassi a due microgrammi per millilitro, o una concentrazione di gentamicina superiore rispetto a senza trattamento con gentamicina.

La soglia di intensità di cutoff a 0,60 ha concluso che Pseudomonas aeruginosa era metabolicamente inibito a due microgrammi per millilitro e concentrazioni più elevate di gentamicina. L'SC-MIC per Pseudomonas aeruginosa contro la gentamicina in un normale mezzo MHB è stato determinato essere di due microgrammi per millilitro, che era all'interno dell'intervallo di differenza di una volta con MIC di quattro microgrammi per millilitro determinato dal metodo di microdiluizione del brodo. Il test rapido di sensibilità antimicrobica, o AST, di campioni di urina con spike di Escherichia coli è stato effettuato mediante imaging SRS.

L'SC-MIC per il campione di urina con picco di Escherichia coli contro amoxicillina è stato determinato essere di quattro microgrammi per millilitro, che ha la stessa lettura di suscettibilità del MIC di otto microgrammi per millilitro con il metodo di diluizione del brodo convenzionale per Escherichia coli puro in mezzo MHB normale. L'applicabilità dell'AST rapido di Pseudomonas aeruginosa spike nel sangue umano è stata studiata mediante imaging SRS. L'intensità CD dell'immagine SRS a 2.168 per centimetro era dominata da segnali batterici provenienti dall'incorporazione metabolica del deuterio di batteri vivi.

L'SC-MIC per Pseudomonas aeruginosa nel sangue è stato determinato essere di due microgrammi per millilitro, che concordava bene con il risultato MIC standard convenzionale per Pseudomonas aeruginosa nel normale mezzo di crescita. Il numero di cellule batteriche utilizzato per i test di suscettibilità antimicrobica è mantenuto a circa cinque volte 10 alla quinta unità formanti colonia per millilitro, come raccomandato dal Clinical and Laboratory Standards Institute. Una maggiore concentrazione di batteri può portare ad un aumento della concentrazione minima inibitoria.

La combinazione dell'identificazione in situ dei patogeni e della diagnosi rapida dei test di sensibilità antimicrobica potrebbe essere di grande potenziale per la traduzione in una clinica che consenta l'identificazione tempestiva di agenti antimicrobici appropriati per un trattamento preciso.