Visualizzazione della funzione respiratoria mitocondriale utilizzando Citocromo C Ossidasi / succinato deidrogenasi (COX / SDH) Doppio etichettatura Istochimica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consentire la visualizzazione diretta delle carenze degli enzimi respiratori mitocondriali in sezioni di tessuto fresco congelato. Ciò si ottiene raccogliendo prima le sezioni del criostato dall'organo di interesse. Il secondo passo della procedura consiste nell'eseguire l'istochimica di Cox, seguita dall'istochimica SDH.

Infine, le sezioni di tessuto vengono disidratate, montate e coperchiate scivolate. In definitiva, i risultati possono mostrare la quantità di disfunzione mitocondriale attraverso la quantità di colorazione blu cellulare. Hi.Today parleremo della tecnica ISTOCHIMICA di doppia marcatura Cox SCH.

E mentre questo metodo può essere applicato per studiare le malattie dei mitocondri, può anche fornire informazioni sull'invecchiamento e sui disturbi legati all'età. Dopo aver rimosso il cervello da un animale che è stato sacrificato in conformità con il permesso etico, congelalo rapidamente su ghiaccio secco. Il fazzoletto congelato può essere conservato a meno 80 gradi Celsius, avvolto in un foglio di alluminio fino al momento della sezione.

Preparare il tessuto per la criosezione posizionando il cervello su un mandrino del criostato e circondandolo con un composto incorporante. Posiziona rapidamente il mandrino nel criostato e raccogli sezioni da 14 micron a meno 21 gradi Celsius. Scongelare le sezioni sui vetrini utilizzando un blocco riscaldante, quindi lasciare asciugare i vetrini a temperatura ambiente per un'ora.

Posizionare i vetrini in una camera di colorazione dei vetrini con strisce di carta bagnate. Poiché i tempi di reazione sono importanti in questo test, si consiglia di elaborare un massimo di 10 vetrini per esperimento sotto una cappa chimica. Preparare l'incubazione, terreno contenente dab e citocromo C in PBS e vortex.

Aggiungere rapidamente due microgrammi di CDE bovini al terreno e mescolare bene vorticando. Per rompere tutti i grani di CDE ancora in funzione sotto la cappa, applicare da 150 a 200 microlitri di terreno di incubazione su ciascun vetrino utilizzando la punta della pipetta per distribuire uniformemente su tutte le sezioni. Incubare i vetrini per 40 minuti a 37 gradi Celsius.

Dopo 40 minuti, rimuovere il terreno di incubazione dai vetrini. Lavare i vetrini quattro volte in PBS per 10 minuti ogni volta. Dopo aver lavato i vetrini, rimetterli nella camera di colorazione dei vetrini con strisce di carta bagnate che lavorano sotto una cappa chimica.

Preparare la soluzione NBT in PBS, avendo cura di proteggere la PMS dal vortice luminoso, applicare rapidamente da 150 a 200 microlitri della soluzione NBT su ogni vetrino utilizzando la punta della pipetta per distribuire uniformemente su tutte le sezioni. Incubare i vetrini per 40 minuti a 37 gradi Celsius dopo 40 minuti, rimuovere la soluzione in eccesso dai vetrini. Lavare i vetrini quattro volte in PBS per 10 minuti ogni volta.

Disidratare i vetrini per due minuti ciascuno nelle seguenti concentrazioni sequenziali di etanolo. 70%70%95%95%e 99,5%Infine, attendere 10 minuti in un ulteriore passaggio del 99,5%. Posizionare i vetrini nello xilene per 10 minuti, montarli con LAN e applicare i vetrini.

Lasciare asciugare i vetrini durante la notte o almeno una o due ore in un'area ventilata qui. Sezioni cerebrali di tipo selvatico e invecchiamento precoce. MT. I topi mutatori del DNA sono stati marcati in sequenza per le attività di COX e SDH.

La normale attività di Cox indicata dalla colorazione marrone scuro è osservata nell'ippocampo dei topi wild type. Le carenze di Cox indicate dalla colorazione blu sono state rivelate nell'ippocampo da topi mutatori di DNA MT a 12 e 46 settimane. C'è stata un'ulteriore diminuzione dell'attività di Cox entro le 46 settimane di età nei topi mutatori M-T-D-N-A, suggerendo una diffusa esacerbazione della disfunzione della catena respiratoria.

Tempi di incubazione inadeguati di 10 e 25 minuti hanno comportato una riduzione della deposizione del prodotto di reazione del dab marrone. I tempi di incubazione ridotti hanno permesso la formazione del prodotto finale del forano blu durante l'incubazione SDH, suggerendo in modo fuorviante la presenza di cellule con carenze di COX, scivolamento della copertura. I vetrini durante l'incubazione di COX hanno anche provocato una formazione e una deposizione imprecise del prodotto di reazione DAB.

Sebbene le attività di Cox e SDH possano essere etichettate individualmente come mostrato qui, la marcatura sequenziale si è dimostrata vantaggiosa nella localizzazione delle cellule con disfunzione mitocondriale. Un esempio di controllo della specificità per le attività di COX e SDH nel cervello di un topo wild type mostra una marcatura negativa. Quindi non dimenticare che lavorare con le sostanze chimiche nella doppia etichettatura Cox SCH è il protocollo chimico è estremamente pericoloso e precauzioni come indossare un abbigliamento da laboratorio adeguato e una maschera che lavora sotto il cappuccio chimico, e anche lo smaltimento del mezzo di incubazione dovrebbe essere fatto ogni volta che si esegue questo test.