Visualizzazione della funzione respiratoria mitocondriale utilizzando Citocromo C Ossidasi / succinato deidrogenasi (COX / SDH) Doppio etichettatura Istochimica
23 novembre 2011
Il citocromo c ossidasi / sodio deidrogenasi (COX / SDH) doppio metodo di etichettatura permette di visualizzare direttamente mitocondriale deficit enzimatici respiratori nei fresco congelato sezioni di tessuto. Questa è una tecnica semplice istochimiche ed è utile nelle indagini malattie mitocondriali, invecchiamento e patologie legate all'invecchiamento.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consentire la visualizzazione diretta delle carenze degli enzimi respiratori mitocondriali in sezioni di tessuto fresco congelato. Ciò si ottiene raccogliendo prima le sezioni del criostato dall'organo di interesse. Il secondo passo della procedura consiste nell'eseguire l'istochimica di Cox, seguita dall'istochimica SDH.
Infine, le sezioni di tessuto vengono disidratate, montate e coperchiate scivolate. In definitiva, i risultati possono mostrare la quantità di disfunzione mitocondriale attraverso la quantità di colorazione blu cellulare. Hi.Today parleremo della tecnica ISTOCHIMICA di doppia marcatura Cox SCH.
E mentre questo metodo può essere applicato per studiare le malattie dei mitocondri, può anche fornire informazioni sull'invecchiamento e sui disturbi legati all'età. Dopo aver rimosso il cervello da un animale che è stato sacrificato in conformità con il permesso etico, congelalo rapidamente su ghiaccio secco. Il fazzoletto congelato può essere conservato a meno 80 gradi Celsius, avvolto in un foglio di alluminio fino al momento della sezione.
Preparare il tessuto per la criosezione posizionando il cervello su un mandrino del criostato e circondandolo con un composto incorporante. Posiziona rapidamente il mandrino nel criostato e raccogli sezioni da 14 micron a meno 21 gradi Celsius. Scongelare le sezioni sui vetrini utilizzando un blocco riscaldante, quindi lasciare asciugare i vetrini a temperatura ambiente per un'ora.
Posizionare i vetrini in una camera di colorazione dei vetrini con strisce di carta bagnate. Poiché i tempi di reazione sono importanti in questo test, si consiglia di elaborare un massimo di 10 vetrini per esperimento sotto una cappa chimica. Preparare l'incubazione, terreno contenente dab e citocromo C in PBS e vortex.
Aggiungere rapidamente due microgrammi di CDE bovini al terreno e mescolare bene vorticando. Per rompere tutti i grani di CDE ancora in funzione sotto la cappa, applicare da 150 a 200 microlitri di terreno di incubazione su ciascun vetrino utilizzando la punta della pipetta per distribuire uniformemente su tutte le sezioni. Incubare i vetrini per 40 minuti a 37 gradi Celsius.
Dopo 40 minuti, rimuovere il terreno di incubazione dai vetrini. Lavare i vetrini quattro volte in PBS per 10 minuti ogni volta. Dopo aver lavato i vetrini, rimetterli nella camera di colorazione dei vetrini con strisce di carta bagnate che lavorano sotto una cappa chimica.
Preparare la soluzione NBT in PBS, avendo cura di proteggere la PMS dal vortice luminoso, applicare rapidamente da 150 a 200 microlitri della soluzione NBT su ogni vetrino utilizzando la punta della pipetta per distribuire uniformemente su tutte le sezioni. Incubare i vetrini per 40 minuti a 37 gradi Celsius dopo 40 minuti, rimuovere la soluzione in eccesso dai vetrini. Lavare i vetrini quattro volte in PBS per 10 minuti ogni volta.
Disidratare i vetrini per due minuti ciascuno nelle seguenti concentrazioni sequenziali di etanolo. 70%70%95%95%e 99,5%Infine, attendere 10 minuti in un ulteriore passaggio del 99,5%. Posizionare i vetrini nello xilene per 10 minuti, montarli con LAN e applicare i vetrini.
Lasciare asciugare i vetrini durante la notte o almeno una o due ore in un'area ventilata qui. Sezioni cerebrali di tipo selvatico e invecchiamento precoce. MT. I topi mutatori del DNA sono stati marcati in sequenza per le attività di COX e SDH.
La normale attività di Cox indicata dalla colorazione marrone scuro è osservata nell'ippocampo dei topi wild type. Le carenze di Cox indicate dalla colorazione blu sono state rivelate nell'ippocampo da topi mutatori di DNA MT a 12 e 46 settimane. C'è stata un'ulteriore diminuzione dell'attività di Cox entro le 46 settimane di età nei topi mutatori M-T-D-N-A, suggerendo una diffusa esacerbazione della disfunzione della catena respiratoria.
Tempi di incubazione inadeguati di 10 e 25 minuti hanno comportato una riduzione della deposizione del prodotto di reazione del dab marrone. I tempi di incubazione ridotti hanno permesso la formazione del prodotto finale del forano blu durante l'incubazione SDH, suggerendo in modo fuorviante la presenza di cellule con carenze di COX, scivolamento della copertura. I vetrini durante l'incubazione di COX hanno anche provocato una formazione e una deposizione imprecise del prodotto di reazione DAB.
Sebbene le attività di Cox e SDH possano essere etichettate individualmente come mostrato qui, la marcatura sequenziale si è dimostrata vantaggiosa nella localizzazione delle cellule con disfunzione mitocondriale. Un esempio di controllo della specificità per le attività di COX e SDH nel cervello di un topo wild type mostra una marcatura negativa. Quindi non dimenticare che lavorare con le sostanze chimiche nella doppia etichettatura Cox SCH è il protocollo chimico è estremamente pericoloso e precauzioni come indossare un abbigliamento da laboratorio adeguato e una maschera che lavora sotto il cappuccio chimico, e anche lo smaltimento del mezzo di incubazione dovrebbe essere fatto ogni volta che si esegue questo test.
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Panoramica
Il metodo di doppia marcatura citocromo c ossidasi/sodio deidrogenasi (COX/SDH) consente la visualizzazione delle carenze degli enzimi respiratori mitocondriali in sezioni di tessuto fresche-congelati. Questa tecnica istochimica è particolarmente utile per investigare le malattie mitocondriali e i disturbi legati all'invecchiamento.
Componenti chiave dello studio
Area di Scienza
- Neuroscienza
- Biochimica
- Ricerca Mitocondriale
Sfondo
- La disfunzione mitocondriale è legata a varie malattie.
- Comprendere le carenze enzimatiche può aiutare nella diagnosi dei disturbi mitocondriali.
- Le tecniche istochimiche forniscono una visualizzazione diretta dell'attività enzimatica.
- Le sezioni di tessuto fresche-congelati preservano l'architettura cellulare.
Obiettivo dello studio
- Visualizzare le carenze degli enzimi respiratori mitocondriali.
- Investigare il ruolo della disfunzione mitocondriale nelle malattie.
- Fornire un metodo semplice per i ricercatori.
Metodi utilizzati
- Raccolta di sezioni criostato dall'organo di interesse.
- Esecuzione dell'istochimica COX.
- Esecuzione dell'istochimica SDH.
- Disidratazione, montaggio e copertura delle sezioni di tessuto.
Principali risultati
- I risultati indicano il livello di disfunzione mitocondriale.
- La colorazione blu cellulare si correla con l'attività enzimatica.
- Il metodo consente una chiara visualizzazione delle carenze enzimatiche.
- I risultati possono contribuire alla comprensione dell'invecchiamento e dei disturbi correlati.
Conclusioni
- Il metodo di doppia marcatura COX/SDH è efficace per studiare la disfunzione mitocondriale.
- Questa tecnica può aiutare nella diagnosi delle malattie mitocondriali.
- Fornisce preziose informazioni sui cambiamenti mitocondriali legati all'invecchiamento.
Domande Frequenti
Executive Industry Relevance
Mitochondrial respiratory function assessment is critical for target validation in neurodegenerative and age-related disease programs. The COX/SDH double-labeling histochemical method enables direct visualization of enzyme deficiencies, supporting mechanistic de-risking of mitochondrial targets. This approach provides predictive confidence in early discovery by linking mtDNA integrity to functional bioenergetics readouts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking mtDNA-encoded COX activity to respiratory chain function.
- Operational Value: Enables functional target validation through direct histochemical readout of enzyme activity in tissue sections.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that rescue COX-deficient phenotypes in disease models.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing baseline mitochondrial function.
- Operational Value: Delivers quantitative, spatially resolved enzyme activity data through DAB and NBT product localization.
- Platform Reuse: Enables scalable assessment of mitochondrial health across multiple organ systems using standardized histochemical workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by modeling mitochondrial dysfunction observed in aging and mtDNA mutator models.
- Operational Value: Provides continuity from discovery through preclinical validation via consistent enzyme activity readouts.
- Risk Mitigation: Informs risk-adjusted advancement decisions by quantifying respiratory chain dysfunction over time.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation by providing functional mitochondrial readouts.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by visualizing COX and SDH activity in defined brain regions.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized incubation, washing, and dehydration steps ensuring reproducible staining.
- Analytics: Enables comparative condition analysis via quantitative blue and brown staining correlating with SDH and COX activity.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by modeling age-dependent exacerbation of respiratory chain dysfunction in mutator mice.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable histochemical platform for mitochondrial assessment across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity in mitochondrial disease models.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability of enzyme activity visualization across sections.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk in mitochondrial programs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on functional rescue of COX-deficient cells.
Implementation Considerations
- Requires expertise in histochemistry and mitochondrial biology for accurate assay execution and interpretation.
- Depends on cryostat, incubation chambers, and chemical hoods for section preparation and reagent handling.
- Necessitates cross-team standardization of incubation times, reagent concentrations, and washing protocols to avoid artifacts.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-neural tissues such as heart or liver.
- Includes practical limitations such as hazardous reagent handling (DAB, NBT, PMS) and the need for fresh-frozen tissue preservation.
