Ad alta risoluzione respirometria mitocondriale per valutare la funzione in permeabilizzate e cellule intatte

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare la respirometria ad alta risoluzione per determinare il consumo di ossigeno mitocondriale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle sindromi e nelle malattie associate alla disfunzione mitocondriale come; sepsi, diverse malattie neurologiche e disturbi legati all'età. I principali vantaggi di questa tecnica sono la maggiore sensibilità e la capacità di eseguire esperimenti di titolazione di inibitori accoppiati con un numero ridotto di campioni biologici come cellule intatte o permeabilizzate.

A dimostrare la procedura sarà Sandra Nansoz, un tecnico del mio laboratorio. Prima di iniziare la procedura, l'aria calibra i sensori polarografici di ossigeno, quindi risospende le cellule nel tampone respiratorio a una concentrazione di una volta dieci fino alla sesta cellula per millilitro e sostituisce il mezzo di respirazione in una camera dell'ossigrafo con 2,1 millilitri di sospensione cellulare. Chiudere la camera con il tappo e impostare l'ancoretta magnetica nella camera a 700 rotazioni al minuto.

Quindi registrare la respirazione cellulare per 5-10 minuti fino a raggiungere un segnale di flusso di ossigeno stabile. Successivamente, utilizzare una siringa per iniettare due microlitri di Rotenone attraverso la porta di iniezione del titanio nella camera dell'ossigrafo e registrare la respirazione cellulare per altri 5-10 minuti. Quando si ottiene un segnale di flusso di ossigeno stabile, iniettare 20 microlitri di un molare di succinato seguiti da 10 microlitri di ADP molare 0,5

Quindi iniettare due volumi di due microlitri di digitonina millimolare e registrare la respirazione cellulare per due-cinque minuti dopo ogni iniezione, seguita dall'iniezione graduale di due microlitri di digitonina millimolare fino a quando il segnale del flusso di ossigeno raggiunge il livello massimo e ulteriori iniezioni di digitonina non aumentano la frequenza respiratoria. Per la valutazione dell'integrità della membrana esterna mitocondriale, preparare una camera ossigrafica come appena dimostrato e iniettare due microlitri di digitonina da otto millimolari per permeabilizzare le cellule. Dopo cinque minuti, iniettare 20 microlitri di un molare succinato e registrare la respirazione cellulare per 5-10 minuti fino a raggiungere un segnale di flusso di ossigeno stabile.

Quindi iniettare 10 microlitri di ADP molare 0,5 per stimolare il complesso due e indurre un aumento del consumo di ossigeno. Quando si ottiene un segnale di flusso stabile, iniettare cinque microlitri di citocromo c da quattro millimolari seguiti da un microlitro di quattro milligrammi per millilitro di ligamicina. Per misurare la respirazione stimolata dall'ADP delle cellule di carcinoma epatocellulare epatico, preparare una camera dell'ografo come appena dimostrato e iniettare due microlitri di digitonina millimolare nella camera dell'ossigeno per permeabilizzare le cellule per cinque minuti, seguiti dall'iniezione di 12,5 microlitri di molare 0,8 molare e 10 microlitri di due molari di glutammato.

Quando si ottiene un flusso di ossigeno stabile, iniettare 10 microlitri di ADP molare 0,5 molare per aumentare il consumo di ossigeno, seguiti da due microlitri di rotenone 0,2 millimolare e 20 microlitri di un molare succinato. Successivamente, iniettare due microlitri di antimicina millimolare e registrare la respirazione cellulare. Quando il segnale diminuisce e si stabilizza, iniettare 2,5 microlitri di escorbato 0,8 millimolare seguiti dall'iniezione immediata di 2,5 microlitri di TMPD 0,2 millimolari, registrando la respirazione cellulare fino a quando il segnale del flusso di ossigeno aumenta e si stabilizza.

Quindi iniettare 10 microlitri di un molare di azite di sodio nella camera dell'ossigrafo e registrare l'aspirazione cellulare fino a quando il segnale del flusso di ossigeno non diminuisce e si stabilizza. Per misurare il consumo di ossigeno delle cellule intatte, preparare una camera per ossigrafo come appena dimostrato e iniettare 1 microlitro di aligimicina da quattro milligrammi per millilitro seguito da iniezioni di uno e tre microlitri di FCCP 0,2 millimolari. Successivamente, titolare l'FCCP in incrementi da 0,1 a 0,3 micromolari iniettando da uno a tre microlitri di FCCP da 0,2 a un millimolare fino a quando il segnale del flusso di ossigeno raggiunge il suo livello massimo senza ulteriori aumenti, quindi inizia a diminuire.

Quindi, iniettare due microlitri di rotenone 0,2 millimolare e due microlitri di antimicina A millimolare e registrare la respirazione fino a quando il segnale del flusso di ossigeno diminuisce e si stabilizza. In assenza di digitonina, la respirazione cellulare è molto bassa e la respirazione di cellule intatte e non permeabilizzate non è stimolata in presenza di substrato mitocondriale e ADP. Dopo l'aggiunta graduale di digitonina, tuttavia, la membrana plasmatica cellulare diventa permeabilizzata e la respirazione mitocondriale aumenta fino alla completa permeabilizzazione, momento in cui il succinato e l'ADP entrano nelle cellule.

L'integrità della membrana esterna mitocondriale può essere compromessa, tuttavia, se vengono impiegate quantità eccessive di digitonina, inducendo una riduzione della respirazione da complesso a stato tre dipendente. Il citocromo c non migliora la respirazione da complesso a stato dipendente tre nelle cellule trattate con digitonina, indicando che non vi è perdita di citocromo c dalla membrana esterna mitocondriale e che l'integrità mitocondriale è preservata, anche se il citocromo c può migliorare la respirazione delle cellule trattate con dosi molto elevate di digitonina. L'aggiunta di substrati esogeni dell'attività del complesso mitocondriale dopo la permeablizzazione della digitonina induce un aumento delle frequenze respiratorie massime dei complessi della catena respiratoria mitocondriale uno, due e quattro.

La generazione di livelli respiratori ridotti può essere dovuta alla contaminazione delle camere dell'ossigrafo con inibitori mitocondriali dell'esperimento precedente. In presenza di aligimicina e l'aggiunta sequenziale di FCCP, si osserva la massima frequenza respiratoria disaccoppiata delle cellule. Una volta padroneggiate, ognuna di queste tecniche può essere eseguita in meno di un'ora se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante ricordare ampiamente le camere di lavaggio dell'ossigrafo e i tappi dopo ogni esperimento. Seguendo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come le misurazioni del contenuto di ATP cellulare, ciascuno dei quali presenta nell'attività cimatica, nei livelli di substrato mitocondriale al fine di rispondere a ulteriori domande come se i cambiamenti nella frequenza respiratoria siano dovuti alla mancanza di substrati mitocondriali o alla ridotta attività dei cineti ATP. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della bionecrosi per esplorare la funzione mitocondriale in campi come le malattie mitocondriali acquisite e genetiche, lo stress ossidativo, le lesioni da perfusione cutanea e l'invecchiamento in cellule o fibre intatte o permeabilizzate e mitocondri isolati.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come assistere la funzione dei mitocondri nelle cellule permeabilizzate e intatte utilizzando la respirometria ad alta risoluzione. Non dimenticare che lavorare con antimicina a, rotenone, iozide di sodio, FCCP e aricomicina può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare guanti e camici da laboratorio dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.