Analisi della migrazione cresta neurale cellulare Trunk con un Modified Zigmond Assay Camera

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare la capacità di una molecola di indurre chemiotassi e altre risposte migratorie in cellule del crest neuroectodermico trunkale espiantate. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto i tubi neurali a livello trunkale, di lunghezza compresa approssimativamente tra otto e quindici somiti, e coltivando ciascun tubo neurale durante la notte su coprivetri separati rivestiti di fibronectina, per consentire l'emigrazione delle cellule del crest neurale. Successivamente, viene selezionata una coltura ottimale di crest neurale.

Il tubo neurale viene rimosso dalla coltura e il vetrino contenente la coltura viene montato su una camera di Zigmund modificata in modo che il bordo più dritto della coltura sia parallelo al vettore del gradiente molecolare da applicare attraverso la coltura. Il terzo passaggio consiste nel generare un gradiente molecolare attraverso la coltura e successivamente registrare la migrazione delle cellule della cresta neurale periferica lungo il bordo dritto precedentemente selezionato della coltura. L'ultimo passaggio prevede il tracciamento e l'analisi della migrazione delle cellule della cresta neurale periferica posizionate lungo il bordo selezionato della coltura utilizzando il software Image J.

In definitiva, è possibile determinare se la molecola selezionata è in grado di modificare la direzionalità cellulare o altre caratteristiche migratorie, come la velocità, attraverso l'analisi dei dati relativi alle traiettorie cellulari ottenuti. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti, come il saggio della camera di Boyden, è che può essere applicata a un costo molto ridotto. Questo metodo può essere utilizzato per analizzare la migrazione di cellule già polarizzate presenti alla periferia di colture primarie di espiananti, mediante imaging a intervalli di tempo.

Dopo aver incubato le uova di pollo per 56 ore a 38 gradi Celsius, rimuovere le uova dall'incubatrice, spruzzarle leggermente con etanolo al 70% e lasciarle asciugare mentre si asciugano. Riempire una piastra di Petri di plastica sterile con soluzione di Ringer per pollo e sterilizzare con raggi UV un vassoio di vetro. Riempire una piastra di Petri di vetro di cinque centimetri con dis displays.

Ora rompere le uova e versarle nel vassoio di vetro sterilizzato con raggi UV. Estrarre ogni embrione dal tuorlo tagliando dapprima intorno alle isole ematiche dell'embrione con forbici curve. Quindi, utilizzando pinzette a punta smussata, prendere l'embrione attraverso la sua membrana extraembrionale e posizionarlo nella piastra di Petri preparata contenente la soluzione di Ringer.

Successivamente, selezionare circa nove embrioni compresi tra lo stadio hamburger e lo stadio Hamilton. Negli stadi da 15 a 17, utilizzando un ago di tungsteno, rimuovere tutti i tessuti embrionali anteriori al somite 10 ed eliminare tutti i tessuti embrionali cordali a partire dal quinto somite appena formato. Quindi, tagliare le membrane extraembrionali fino a lasciarne circa due millimetri attorno all'embrione.

Posizionare i tronchi embrionali isolati nelle camere di dissezione e incubarli per un'ora e 15 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica mentre i tronchi embrionali sono in incubazione. Preparare sei coprioggetti per la coltura. Innanzitutto, lavarli in etanolo al 70% e lasciarli asciugare.

Quindi, utilizzando un pennarello da laboratorio, disegnare al centro di ciascun vetrino un cerchio di circa un centimetro di diametro, per l'identificazione successiva del rivestimento di connessione del fibrina sulla stessa faccia di ogni vetrino. Scrivere una parola o un simbolo asimmetrico all'esterno del cerchio disegnato per facilitare l'identificazione della parte superiore e inferiore del vetrino. Posizionare ora ogni vetrino in una piastra sterile separata da 40 per 10 millimetri, con il lato etichettato rivolto verso il basso, e lasciare la piastra aperta sotto una lampada UV germicida per 10 minuti.

Quindi applicare 60 microlitri di fibronectina sulla superficie non marcata del coverslip all'interno del cerchio di un centimetro, assicurandosi che l'intera area del cerchio sia ricoperta. Posizionare le piastre nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Al termine del periodo di incubazione, aspirare con attenzione la fibronectina da ciascun coverslip.

Successivamente, aggiungere 250 microlitri di mezzo di coltura nell'area rivestita con FI nin. La lamellina, quindi incubare nuovamente le lamelline fino all'isolamento dei tubi neurali. Mentre le lamelline sono in incubazione, riempire una piastra di Petri in vetro da cinque centimetri con mezzo L 15.

Ora trasferire tutti i tronchi embrionali incubati nella piastra di Petri preparata. Utilizzare pinzette fini e un ago affilato per dissezionare il tubo neurale, praticando con attenzione un'incisione lungo il margine tra il tubo neurale e i somiti. Rimuovere le lamelle dall'incubatore.

Selezionare sei dei tubi neurali più lunghi e dritti, quindi utilizzando la punta di una micropipetta preriscaldata con mezzo di coltura, trasferire un tubo neurale su ciascuno di sei coprioggetti. Assicurarsi che ciascun tubo neurale si trovi all'interno dell'area rivestita con fibronectina del rispettivo coprioggetto utilizzando una micropipetta e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Successivamente, versare almeno due millilitri di mezzo di coltura senza siero in un tubo da centrifuga sterile da 15 millilitri.

Lasciare il tappo leggermente allentato durante l'incubazione del tubo tutta la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, in modo da permettere al pH del mezzo di aggiustarsi. Dopo la coltura notturna, selezionare le tre migliori colture di cellule della cresta neurale che presentano almeno un bordo lungo e dritto su tre colture. Sceglierne una per caricare la prima camera e rimettere le altre nell'incubatore per un uso successivo.

Quindi, utilizzando il nostro bastoncino di cotone, applicare uno strato sottile e uniforme di vaselina nelle aree circostanti i serbatoi e il ponte di una camera di Sigmund modificata. Successivamente, con un ago di tungsteno, rimuovere delicatamente il tubo neurale dalla lamellina contenente la coltura di cellule della cresta neurale selezionata, lasciando le cellule della cresta neurale circostanti attaccate al rivestimento di fibronectina. Contrassegnare la piastra con un pennarello da laboratorio per ricordare l'orientamento del bordo più dritto della coltura di cellule della cresta neurale.

Successivamente, posizionare alcune gocce del mezzo pre-incubato sul ponte della camera di Zigmund modificata. Prendere quindi il coprioggetto con pinzette fini. Tamponare il bordo del coprioggetto contro un fazzoletto di carta Kim per rimuovere la maggior parte del vecchio mezzo di coltura, e posizionare immediatamente il coprioggetto sulla camera di Zigmund modificata in modo che il bordo dritto delle cellule della cresta neurale da filmare sia centrato lungo la lunghezza del ponte e approssimativamente perpendicolare al bordo del serbatoio del ponte.

Utilizzando un microscopio invertito, spostare il bordo dritto delle cellule della cresta neurale sul lato del ponte più vicino al serbatoio. Questo permetterà di contenere il chemiotattante sospettato e allineare più precisamente il bordo dritto delle cellule della cresta neurale perpendicolarmente al bordo del serbatoio del ponte. Ora premere con attenzione ma con fermezza il coperchio, facendolo scivolare nella gelatina di petrolio presente sulla camera di Zigmund, assicurandosi che sia sigillato completamente sulla camera.

Quindi applicare ulteriore vaselina lungo il bordo del vetrino per garantire ulteriormente che la chiusura sia ermetica. Regolare nuovamente l'angolo del margine delle cellule della cresta neurale per correggere eventuali spostamenti avvenuti durante il processo di chiusura. Successivamente, caricare circa 300 microlitri di mezzo pre-incubato in una siringa da un millilitro.

Con un ago da 25 gauge e 1,5 pollici. Iniettare il mezzo nel serbatoio che non conterrà alcun chemiotattico fino a quando non sarà pieno, avendo cura di non generare bolle d'aria nel serbatoio.

Quindi tappare il serbatoio su entrambi i lati con una quantità sufficiente di vaselina prima di caricare il serbatoio successivo. Ora caricare una seconda siringa con 300 microlitri di mezzo pre-incubato contenente il chemiotattico desiderato. Quindi iniettare il mezzo nel serbatoio opposto nello stesso modo.

Di nuovo, sigillare attentamente il serbatoio con vaselina. Incubare la camera di Sigmund caricata a 37 gradi Celsius per un'ora prima della ripresa. Successivamente, durante l'incubazione a circa 37 gradi Celsius, acquisire l'immagine del bordo più dritto della coltura di cellule della cresta neurale per tre ore a intervalli di 92 minuti; come controllo, caricare camere di Zigmund contenenti ciascuna delle altre due migliori colture di cellule della cresta neurale, come appena mostrato.

Utilizzare i trattamenti di controllo appropriati per riempire i serbatoi e inizializzare il ponte. Utilizzare il plugin manuale di tracciamento di ImageJ per seguire la migrazione delle cellule della cresta neurale periferica lungo il bordo rettilineo della coltura. Utilizzare il plugin dello strumento di chemiotassi e migrazione per analizzare diversi parametri delle traiettorie migratorie ottenute.

Colture cellulari di crestaneurale del tronco allungate sono state preparate coltivando durante la notte tubi neurali e le colture cellulari di crestaneurale risultanti, selezionando per l'esperimento quelle con almeno un bordo lungo e dritto. Il bordo dritto più lungo di una coltura selezionata è stato quindi posizionato perpendicolarmente al bordo del serbatoio ponte, e quindi parallelamente al vettore del gradiente che sarebbe stato applicato successivamente. Il serbatoio che non conteneva il sospetto chemiottirante, indicato qui con un segno meno, è stato caricato per primo e sigillato.

Successivamente, l'altro serbatoio è stato caricato con l'agente chemiotattico sospettato, rappresentato con un segno più, e sono state immaginate e tracciate le cellule della cresta neurale periferica sigillate lungo il bordo precedentemente selezionato, utilizzando il plugin di tracciamento manuale per ImageJ. Numerose caratteristiche migratorie in risposta al gradiente applicato possono essere valutate sulla base dei dati di tracciamento ottenuti, come illustrato in questo grafico. Ad esempio, un indice di chemiotassi può essere calcolato dividendo lo spostamento della cellula lungo l'asse x per la distanza totale percorsa. La risposta attrattiva di tutte le cellule tracciate è dimostrata dal grafico delle traiettorie cellulari mostrato qui.

Ogni traccia rossa rappresenta la traiettoria di una cellula che si è spostata verso il serbatoio contenente un sospetto chemiotattrante. In questa figura, il numero di tracce rosse è notevolmente maggiore rispetto a quello delle tracce nere. In un altro test, è stata convalidata la capacità di una camera sigmund modificata di mantenere un gradiente molecolare.

È stato aggiunto un coniugato Alexa Fluor 488 IGM al serbatoio sinistro e l'intensità di fluorescenza attraverso il ponte è stata misurata in diversi momenti. Il gradiente è rimasto stabile per almeno 26 ore. Dopo aver visto il video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come analizzare la capacità di una molecola di indurre chemiotassi e altri comportamenti migratori in colture di cellule della cresta neurale trunkale espiantate, utilizzando un saggio modificato con camera di Zigmond.