Analisi della migrazione cresta neurale cellulare Trunk con un Modified Zigmond Assay Camera

Lo scopo generale di questa procedura è valutare la capacità di una molecola di suscitare chemiotassi e altre risposte migratorie nelle cellule della cresta neurale del tronco espiantate. Ciò si ottiene isolando prima i tubi neurali a livello del tronco tra circa 8 e 15 somiti di lunghezza e coltivando ciascuno dei tubi neurali durante la notte su vetrini coprioggetti rivestiti di fibronectina separati per consentire l'emigrazione della cresta neurale. Successivamente, viene selezionata una coltura ottimale della cresta neurale.

Il tubo neurale viene rimosso dalla coltura e il vetrino coprioggetto contenente la coltura viene montato su una camera a zigmund modificata in modo che il bordo più dritto della coltura sia parallelo al vettore del gradiente molecolare da applicare attraverso la coltura. Il terzo passo consiste nel generare un gradiente molecolare attraverso la coltura e quindi filmare la migrazione delle cellule della cresta neurale periferica lungo il bordo rettilineo della coltura precedentemente selezionato. Il passaggio finale consiste nel tracciare e analizzare la migrazione delle cellule della cresta neurale periferica posizionate lungo il bordo selezionato della coltura utilizzando il software Image J.

In definitiva, è possibile determinare se la molecola selezionata può alterare la direzionalità cellulare o altre caratteristiche migratorie come la velocità attraverso l'analisi dei dati di traiettoria cellulare ottenuti. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti come il saggio a camera di Boyden, è che ha un costo molto basso. Questo metodo può essere utilizzato per analizzare la migrazione di cellule già polarizzate alla periferia delle colture primarie explan utilizzando l'imaging time-lapse.

Dopo aver incubato le uova di pollo per 56 ore a 38 gradi Celsius, toglietele dall'incubatrice, spruzzatele leggermente con etanolo al 70% e poi lasciate asciugare le uova mentre le uova si asciugano. Riempi una capsula di Petri di plastica sterile con una soluzione Chick ringer e sterilizza UV un vassoio di vetro. Riempire una capsula di Petri di vetro da cinque centimetri con i display.

Ora rompi le uova nel vassoio di vetro sterilizzato con raggi UV. Estrai ogni embrione dal suo tuorlo tagliando prima le isole di sangue dell'embrione con le forbici curve. Quindi, con una pinza smussata, prelevare l'embrione dalla sua membrana extra embrionale e posizionare l'embrione nella capsula di Petri preparata contenente suonerie.

Successivamente, seleziona circa nove embrioni che si trovano tra l'hamburger e l'Hamilton. Gli stadi da 15 a 17 con un ago di tungsteno tagliano tutti i tessuti embrionali anteriori all'acaro 10 e rimuovono tutti i tessuti embrionali cordali a partire da circa il quinto acaro più recente. Quindi tagliare le membrane embrionali in eccesso a circa due millimetri dall'embrione.

Posizionare i tronchi embrionali isolati in decespugliatori e incubarli per un'ora e 15 minuti a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica mentre i tronchi embrionali sono in incubazione. Preparare sei vetrini coprioggetto per la coltura. Per prima cosa sciacquandoli in etanolo al 70% e lasciandoli asciugare.

Quindi, utilizzando un pennarello da laboratorio, disegna un cerchio al centro di ogni vetrino coprioggetti di circa un centimetro di diametro per la successiva identificazione del rivestimento di collegamento in fibrina sulla stessa faccia di ciascun vetrino coprioggetti. Scrivi una parola o un simbolo asimmetrico al di fuori del cerchio disegnato per facilitare l'identificazione della parte superiore e inferiore del foglietto di presentazione. Ora posiziona ogni vetrino coprioggetto in una capsula sterile separata da 40 x 10 millimetri con il lato etichettato rivolto verso il basso e lascia che la capsula rimanga aperta sotto una lampada UV germicida per 10 minuti.

Quindi applicare 60 microlitri di fibronectina sulla superficie non contrassegnata del vetrino coprioggetti all'interno del cerchio di un centimetro, assicurandosi che l'intera area del cerchio sia rivestita. Mettere i piatti nell'incubatrice a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Dopo il periodo di incubazione, aspirare con cura la pinna da ciascun vetrino coprioggetti.

Quindi, aggiungere 250 microlitri di terreno di coltura all'area rivestita di FInin. Il vetrino coprioggetti, quindi incubare nuovamente il vetrino coprioggetto fino a quando i tubi neurali non sono stati isolati. Mentre i vetrini coprioggetti sono in incubazione, riempire una capsula di Petri di vetro da cinque centimetri con terreno L 15.

Trasferire ora tutti i tronchi embrionali incubati nella capsula di Petri preparata. Usa una pinza sottile e una lingua affilata e un ago per sezionare il tubo neurale tagliando con cura lungo il bordo del tubo neurale e i somiti con l'ago. Rimuovere i vetrini di copertura dall'incubatrice.

Selezionare sei dei tubi neurali più lunghi e dritti, quindi utilizzare una punta per micropipetta innescata con terreno di coltura, trasferire un tubo neurale su ciascuno dei sei vetrini di copertura. Assicurarsi che ogni tubo neurale si trovi all'interno dell'area rivestita di fibronectina del rispettivo vetrino coprioggetti utilizzando una micropipetta e incubare la notte a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Quindi inserire almeno due millilitri di terreno di coltura senza siero in una provetta da centrifuga sterile da 15 millilitri.

Lasciare il vitello leggermente svitato durante l'incubazione della provetta per una notte a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per consentire la regolazione del pH del terreno. Dopo la coltura notturna, selezionare le tre migliori colture cellulari della cresta neurale che hanno almeno un bordo lungo e dritto fuori dalle tre colture. Scegline uno per caricare la prima camera e rimetti gli altri nell'incubatrice per un uso successivo.

Quindi, utilizzando il nostro batuffolo di cotone, applicare uno strato sottile e uniforme di vaselina sulle aree circostanti i serbatoi e il ponte di una camera di Sigmund modificata. Successivamente, con un ago di tungsteno, rimuovere delicatamente il tubo neurale dal vetrino coprioggetto contenente la coltura cellulare della cresta neurale selezionata, lasciando le cellule della cresta neurale circondate attaccate al rivestimento della fibronectina. Contrassegnare la piastra con un pennarello da laboratorio per ricordare l'orientamento del bordo più dritto della coltura cellulare della cresta neurale.

Quindi, posizionare alcune gocce del terreno preincubato sul ponte della camera zigmund modificata. Quindi raccogliere il vetrino coprioggetto con una pinza fine. Tamponare il bordo del vetrino coprioggetti contro un panno Kim per rimuovere la maggior parte del vecchio terreno di coltura e posizionare immediatamente il vetrino coprioggetto sulla camera a zigmund modificata in modo che il bordo dritto della cella della cresta neurale da filmare sia centrato sulla lunghezza del ponte e approssimativamente perpendicolare al bordo del serbatoio del ponte.

Utilizzando un microscopio invertito, spostare il bordo diritto della cella della cresta neurale sul lato del ponte più vicino al serbatoio. Ciò conterrà il sospetto tatto chemioterapico e allineerà più finemente il bordo dritto della cellula della cresta neuro perpendicolare al bordo del serbatoio del ponte. Ora premere con attenzione ma con sicurezza il coperchio, infilarlo nella vaselina presente sulla camera zigmund, assicurandosi che sia completamente sigillata sulla camera.

Quindi posizionare altra vaselina lungo il bordo del vetrino coprioggetti per assicurarsi ulteriormente che sia ermetico. Regola nuovamente l'angolo del bordo della cella della cresta neurale per correggere qualsiasi movimento durante il processo del soffitto. Quindi, caricare circa 300 microlitri di terreno preincubato in una siringa da un millilitro.

Con un ago attaccato da 25 gauge per 1,5 pollici. Iniettare il terreno nel serbatoio che non conterrà alcun tatto chemioterapico fino a quando non sarà pieno. Fare attenzione a non generare bolle nel serbatoio.

Quindi tappare il serbatoio su entrambi i lati con una quantità sufficiente di vaselina prima di caricare il serbatoio successivo. Caricare ora una seconda siringa con 300 microlitri di terreno pre-incubato contenente il chemio tatto desiderato. Quindi iniettare il fluido nel serbatoio opposto allo stesso modo.

Ancora una volta, sigillando accuratamente il serbatoio con vaselina. Dopo aver incubato la camera Sigmund carica a 37 gradi Celsius per un'ora prima delle riprese. Quindi, durante l'incubazione a circa 37 gradi Celsius, il bordo più dritto della coltura cellulare della cresta neurale per tre ore a intervalli di 92 per i controlli, caricare le camere a zigmund contenenti ciascuna delle altre due migliori colture cellulari della cresta neurale come appena mostrato.

Utilizzando gli opportuni trattamenti di controllo per il riempimento dei serbatoi e l'adescamento del ponte. Utilizzare il plug-in trackin manuale J image per tracciare la migrazione delle cellule della cresta neurale periferica lungo il bordo rettilineo della coltura. Utilizza il plug-in dello strumento di chemiotassi e migrazione per analizzare vari parametri delle traiettorie migratorie ottenute.

Le colture cellulari della cresta neurale del tronco allungato sono state preparate mediante coltura notturna di tubi neurali e sono state selezionate per la sperimentazione le colture cellulari della cresta neurale risultanti con almeno un lungo bordo rettilineo. Il bordo rettilineo più lungo di una coltura selezionata è stato quindi posizionato perpendicolarmente al bordo del bacino idrico del ponte, e quindi parallelo al vettore del futuro gradiente applicato. Il serbatoio che non conteneva il sospetto chemioattrattivo qui rappresentato con un segno meno è stato caricato per primo e sigillato.

Quindi l'altro serbatoio è stato caricato con il sospetto chemioattrattivo rappresentato con un segno più e le cellule della cresta neurale periferica sigillate lungo il bordo precedentemente selezionato sono state quindi visualizzate e tracciate utilizzando il plug-in di tracciamento manuale per l'immagine J.Numerose caratteristiche migratorie in risposta al gradiente applicato possono essere valutate sulla base dei dati di tracciamento ottenuti come illustrato in questo grafico. Ad esempio, un indice di chemiotassi può essere derivato dividendo lo spostamento di una cellula lungo l'asse x per la distanza totale percorsa. La risposta attrattiva di tutte le cellule tracciate è dimostrata dal grafico della traiettoria cellulare mostrato qui.

Ogni traccia rossa è la traiettoria di una cellula che è migrata verso il serbatoio carica di un sospetto chemioattrattivo. In questa figura, c'è una quantità sostanzialmente maggiore di tracce rosse rispetto al nero. In un altro test, è stata convalidata la capacità di una camera di Sigmund modificata di mantenere un gradiente molecolare.

Un coniugato Alexa Fluor 4 88 IGM è stato aggiunto al serbatoio sinistro e l'intensità della fluorescenza attraverso il ponte è stata misurata in vari momenti. Il gradiente è rimasto per almeno 26 ore Dopo aver visto il video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare la capacità di una molecola di suscitare chemiotassi e altri comportamenti migratori in colture cellulari di cresta neurale del tronco espiantate utilizzando un saggio in camera di Zigmund modificato.