Una camera per la migrazione delle cellule di misura personalizzabile

L'obiettivo generale di questa procedura è fornire un modo semplice per studiare gli effetti di agenti chemiotattici e chemiorepulsivi sulla migrazione cellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo delle interazioni cellulari, come gli effetti di diversi fattori di crescita sulla guarigione delle ferite. Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere facilmente personalizzata per diverse applicazioni ed è semplice da usare per ricercatori di ogni livello di competenza.

La procedura sarà dimostrata da Aniqa Chowdhury, una studentessa universitaria, e da Tyler Harvey, uno studente laureato del mio laboratorio. Per iniziare, creare un file CAD con la forma desiderata del microcanale. Regolare la larghezza e la lunghezza del canale per ottenere il gradiente richiesto.

Qui, quadrati di 2,254 centimetri sono collegati da un canale largo 0,127 centimetri. Successivamente, procurarsi un pezzo di acrilico dello spessore desiderato per creare la profondità corretta del microcanale. Uno spessore di circa un sedicesimo di pollice è ideale poiché fogli più spessi sono difficili da tagliare e fogli molto sottili possono rompersi o deformarsi durante il processo.

Importare il file CAD in un'apparecchiatura per il taglio laser e posizionare il pezzo in acrilico sulla superficie di taglio. Quindi, tagliare la camera seguendo il protocollo del produttore. Posizionare il ritaglio appena tagliato a forma di manubrio in una piccola capsula di Petri e coprirlo fino al momento dell'utilizzo.

In una barchetta per pesatura, aggiungere dieci parti di una base di elastomero con una parte di agente indurente e mescolare utilizzando una pipetta microlitrica per cinque minuti. Trasferire la miscela in una camera a vuoto ed applicare il vuoto per 30 minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate nel PDMS. Al termine, spegnere il vuoto ed estrarre la barchetta per pesatura.

Versare il PDMS disaerato sopra un ritaglio di acrilico a forma di manubrio in una piccola piastra di Petri. Assicurarsi che il PDMS ricopra completamente l'inserto. Lasciare polimerizzare il PDMS per almeno 18 ore a temperatura ambiente, quindi tagliare con cura il PDMS intorno al pezzo di acrilico utilizzando un bisturi ed estrarre l'inserto.

In un tipico armadio per colture cellulari, posizionare la camera a microcanali in una piastra di Petri, con il lato strutturato rivolto verso l'alto, e coprirla completamente con etanolo al 70%. Chiudere quindi il capo aspirante e accendere la lampada a luce UV. Esporre la camera alla luce UV per uno o due ore.

Dopo l'esposizione, aprire la cappa a flusso laminare e attendere 15 minuti affinché la cappa ristabilisca il flusso. Successivamente, rimuovere l'etanolo al 70% e lavare le camere due volte con PBS sterile. Utilizzare un millilitro di PBS per ogni lavaggio.

Dopo il lavaggio finale, rimuovere il PBS e lasciare asciugare le camere durante la notte con i coperchi rimossi. Raccogliere il tipo di cellule da testare e aggiungere 100 microlitri della sospensione cellulare a 400 microlitri di blu di tripano allo 0,4% e mescolare delicatamente. Applicare 100 microlitri di questa soluzione all'emocitometro riempiendo delicatamente entrambe le camere sotto il coprioggetto di vetro.

Utilizzare un microscopio con un obiettivo 10x per mettere a fuoco la griglia dell'emocitometro. Quindi, utilizzare un contatore manuale per contare le cellule vitali non colorate all'interno di tutti e quattro i gruppi di 16 quadrati presenti sull'emocitometro. Dividere il numero totale di cellule per quattro e moltiplicare questo valore per 50.000 per ottenere il numero di cellule per millilitro di sospensione cellulare.

In base a questo calcolo, aggiungere 2500 cellule e 100 microlitri di terreno in una pozzetta per ogni camera. Lasciare le cellule in camera per 60 minuti, quindi aggiungere ulteriore terreno. Per iniziare, aggiungere agarosio all'acqua e riscaldare la soluzione in microonde per un minuto, oppure fino a quando l'agarosio si sarà completamente disciolto e la soluzione risulterà limpida.

Lasciare raffreddare la soluzione per 15-30 secondi prima di versarla in una piastra di Petri. Per rimuovere eventuali bolle d'aria, inserire la piastra di Petri in una camera a vuoto e lasciare solidificare l'agarosio sotto vuoto per 30 minuti. Una volta solidificato, tagliare un cubo di agarosio di due millimetri per due millimetri per due millimetri con un bisturi prelevandolo dalla piastra di Petri.

Immergere completamente il cubo in una soluzione contenente la concentrazione desiderata del fattore chemiotattico e lasciare in ammollo il blocco di agarosio tutta la notte a temperatura ambiente. Successivamente, posizionare il blocco di agarosio contenente il fattore chemiotattico all'estremità opposta della camera a microcanale. Utilizzare un marcatore, come microsfere di polistirene o un difetto microscopico nella camera.

Per identificare la posizione iniziale relativa delle cellule, utilizzare il software di imaging per acquisire immagini a intervalli di tempo della frontiera cellulare in movimento ogni ora per 12 ore. La serie di immagini mostrata documenta lo spostamento della frontiera cellulare lungo il canale in risposta a un gradiente di siero bovino fetale posizionato all'estremità opposta del canale.

La distanza di migrazione è stata misurata in base alla distanza tra il fronte di crescita e un difetto microscopico nel dispositivo. Da queste misurazioni, si è determinato che la velocità media del fronte cellulare è di 13,4 micrometri all'ora. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro ore, con un tempo aggiuntivo di 18 ore di attesa per la polimerizzazione del PDMS e ulteriori 12 ore per l'acquisizione dell'immagine a intervalli di tempo.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada a ricercatori di diversi livelli di competenza, inclusi studenti universitari con poca esperienza di laboratorio, permettendo loro di esplorare facilmente la guarigione delle ferite e la migrazione cellulare in vitro. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di rimuovere con attenzione l'inserto acrilico dallo stampo in PDMS per garantire la corretta produzione di una camera a microcanali. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come produrre una semplice camera a microcanali per lo studio della migrazione cellulare in risposta a diversi segnali chimici.

Seguendo questa procedura, è possibile studiare altri stimoli, come gradienti chimici solubili multipli, substrati, flussi fluidi e campi elettrici, al fine di analizzare il loro effetto sulla migrazione cellulare. Non dimenticare che lavorare con taglierine laser può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come ricevere un'adeguata formazione e utilizzare dispositivi di protezione individuale durante l'esecuzione di questa procedura.