Una camera per la migrazione delle cellule di misura personalizzabile

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire un modo semplice per studiare gli effetti degli agenti chemiotattici e chemorepulsivi sulla migrazione cellulare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi dell'interazione cellulare, come gli effetti di diversi fattori di crescita sulla guarigione delle ferite. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è facilmente personalizzabile per diverse applicazioni e semplice da usare per ricercatori di tutti i livelli.

A dimostrare la procedura saranno Aniqa Chowdhury, una studentessa universitaria, e Tyler Harvey, uno studente laureato del mio laboratorio. Per iniziare, creare un file CAD con la forma desiderata del microcanale. Regolate la larghezza e la lunghezza del canale per ottenere il gradiente richiesto.

Qui, quadrati di 2,254 centimetri sono collegati da un canale largo 0,127 centimetri. Successivamente, ottenere un pezzo di acrilico dello spessore desiderato per creare la corretta profondità del microcanale. Una larghezza del foglio acrilico di circa un sedicesimo di pollice è l'ideale poiché i fogli più spessi sono difficili da tagliare e i fogli molto sottili possono rompersi o deformarsi durante il processo.

Importa il file CAD in un apparecchio di taglio laser e posiziona il pezzo acrilico sulla superficie di taglio. Quindi ritagliare la camera, secondo il protocollo del produttore. Metti il ritaglio acrilico a forma di bilanciere appena tagliato in una piccola capsula di Petri e coprilo fino al momento del bisogno.

In una bilancia, aggiungere dieci parti di una base di elastomero, con una parte di agente indurente e mescolare con una micropipetta per cinque minuti. Trasferire la miscela in una camera a vuoto e aspirare per 30 minuti per rimuovere eventuali bolle d'aria intrappolate dal PDMS. Al termine, spegnere l'aspirapolvere e rimuovere la barca di pesatura.

Versare il PDMS degasato sopra un ritaglio acrilico a forma di bilanciere in una piccola capsula di Petri. Assicurarsi che il PDMS copra completamente l'inserto. Lasciare indurire il PDMS per almeno 18 ore a temperatura ambiente, quindi tagliare con cura il PDMS attorno al pezzo acrilico con un bisturi e rimuovere l'inserto.

In una camera per colture cellulari standard, posizionare la camera a microcanali in una capsula di Petri, con il lato destro rivolto verso l'alto e coprirla completamente con etanolo al 70%. Quindi chiudere il cofano e accendere la luce UV. Esporre la camera ai raggi UV per una o due ore.

Dopo l'esposizione, aprire la cappa a flusso laminare e attendere 15 minuti affinché la cappa a flusso ristabilisca il flusso. Quindi, rimuovere l'etanolo al 70% e lavare le camere due volte con PBS sterile. Utilizzare un millilitro di PBS per ogni lavaggio.

Dopo il lavaggio finale, rimuovere il PBS e lasciare asciugare le camere per una notte senza i coperchi. Raccogliere il tipo di cellula da testare e aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare a 400 microlitri di blu di tripano allo 0,4% e mescolare delicatamente. Applicare 100 microlitri di questa soluzione all'emocitometro riempiendo delicatamente entrambe le camere sotto il vetrino coprivetro.

Utilizzare un microscopio con un obiettivo 10x per mettere a fuoco la griglia dell'emocitometro. Quindi utilizzare un contatore manuale per contare le cellule vive e non sostenute all'interno di tutte e quattro le serie di 16 quadrati sull'emocitometro. Dividi il numero totale di cellule per quattro e moltiplica questo numero per 50.000 per ottenere il numero di cellule per millilitro di sospensione cellulare.

Sulla base di questo calcolo, aggiungere 2500 celle e 100 microlitri di terreno in un pozzetto in ciascuna camera. Lasciare riposare le cellule nella camera per 60 minuti, quindi aggiungere altro terreno. Per iniziare, aggiungi l'agarosio all'acqua e scalda la soluzione in un forno a microonde per un minuto, o fino a quando l'agarosio non si è completamente sciolto e la soluzione è limpida.

Lasciare raffreddare la soluzione per 15-30 secondi prima di versarla in una capsula di Petri. Per rimuovere eventuali bolle, posizionare la capsula di Petri in una camera a vuoto e lasciare solidificare l'agarosio sotto vuoto per 30 minuti. Una volta solidificato, tagliare un cubetto di agarosio di due millimetri per due millimetri con un bisturi dalla capsula di Petri.

Immergere completamente il cubo in una soluzione contenente la concentrazione desiderata del fattore chemiotattico e immergere il blocco di agarosio per una notte a temperatura ambiente. Successivamente, posizionare il blocco di agarosio contenente il fattore chemiotattico all'estremità più lontana della camera del microcanale. Utilizza un pennarello, come microsfere di polistirene o un difetto microscopico nella camera.

Per identificare la posizione iniziale relativa delle celle. Utilizzare il software di imaging per acquisire immagini time-lapse del fronte cellulare in movimento ogni ora per 12 ore. La serie di immagini mostrate qui documenta il movimento di un fronte cellulare attraverso il canale in risposta a un gradiente di siero fetale bovino posto all'estremità opposta del canale.

La distanza di migrazione è stata misurata in base alla distanza del fronte di crescita da un difetto microscopico nel dispositivo. Da queste misurazioni, la velocità media del fronte cellulare è risultata essere di 13,4 micrometri all'ora. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in quattro ore, con ulteriori 18 ore di attesa per la polimerizzazione del PDMS e ulteriori 12 ore per l'imaging time lapse.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada a ricercatori di diversi livelli di abilità, inclusi studenti universitari con poca esperienza di laboratorio, per esplorare facilmente la guarigione delle ferite e la migrazione cellulare in vitro. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di rimuovere con cura l'inserto acrilico dallo stampo PDMS per garantire la corretta produzione di una camera a microcanali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre una semplice camera a microcanali per studiare la migrazione cellulare in risposta a diversi segnali chimici.

Seguendo questa procedura, è possibile studiare altri indizi come gradienti chimici solubili multipli, substrati, fluidi puri e campi elettrici al fine di studiare l'effetto che hanno sulla migrazione cellulare. Non dimenticare che lavorare con i laser cutter può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre precauzioni come ottenere una formazione adeguata e l'uso di dispositivi di protezione individuale.