Confronto quantitativo di Cis-Regulatory Element (CRE) Attività in transgenici Drosophila melanogaster

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di misurare quantitativamente le attività di regolazione genica degli elementi regolatori del CIS o CRE attivi durante lo sviluppo gastrometamorfico di drosophila melan. Iniziare con metodi di integrazione sito-specifici per generare linee di CRE Transgenically Incorporated come transgeni reporter. Utilizzando uno stereomicroscopio, ottenere campioni transgenici del corretto stadio di sviluppo.

Rimuovere i campioni dal pub esterno e montarli su un microscopio di vetro. Il vetrino procede alla registrazione del livello e del pattern di espressione della proteina reporter fluorescente in campioni di montatura intera mediante analisi microscopica confocale. Infine, quantificare il livello di espressione della proteina reporter fluorescente per le immagini confocali registrate utilizzando lo strumento software Image J.

Questi risultati assegnano un livello di attività regolatoria genica per assistere l'elemento regolatorio e facilitare ulteriori studi comparativi sull'espressione genica su versioni modificate di CRE. Questa procedura può aiutare a rispondere a domande chiave e si sente interessato alla regolazione genica e al modo in cui tale regolazione genica sta codificando. Il DNA sembra la biologia dello sviluppo e dell'evoluzione.

Questa procedura è stata sviluppata per fornire informazioni sugli elementi regolatori cis che funzionano durante lo sviluppo metamorfico di drosophila melanogaster. In linea di principio, tuttavia, può essere applicato agli elementi regolatori cis che funzionano durante altre fasi di sviluppo e ad altre specie di moscerini della frutta, o anche ad altri organismi modello. Per espandere le linee transgeniche, allestire due fiale con diversi moscerini maschi e femmine a giorni alterni.

Trasferire le mosche da una delle fiale in una nuova fiala. Ripeti l'operazione per una settimana. Entro la fine delle due settimane, verificare che i moscerini della frutta transgenici vadano dagli stadi di sviluppo larvale a quelli adulti.

Iniziare a mettere in scena i campioni alla fine del terzo stadio larvale quando si forma l'ER. Si noti che l'esemplare non è mobile. L'ER è bianco ammorbidito e le sferiche hanno evitato di specificare questo punto temporale.

Come zero HAPF. Distingueva i maschi dalle femmine per la presenza di gonadi situate bilateralmente vicino al punto medio del corpo che appaiono come cerchi traslucidi per la stadiazione in base alla lunghezza della metamorfosi. A zero HAPF, trasferire i campioni in una fiala nuova utilizzando un pennello inumidito.

Aggiungi un pezzo di salvietta Kim e inumidisci con acqua per evitare che gli esemplari si secchino. Ora, incubare la fiala a 25 gradi Celsius fino all'HAPF desiderato. In alternativa, stadiare gli esemplari mediante ordinamento in base all'identificazione della presenza e della posizione di diversi marcatori morfologici, come descritto nel testo di accompagnamento.

Con il nastro adesivo da laboratorio, far aderire un pezzo di nastro adesivo a una tavola di dissezione con la superficie del nastro adesivo rivolta verso l'alto. Bagnare un pennello e applicare l'umidità sui campioni con un pennello. Trasferisci i campioni in una salvietta Kim.

Trasferire i campioni sul nastro da imballaggio e farli aderire con la superficie dorsale rivolta verso l'alto. Lasciare asciugare gli esemplari per 15 minuti. Aprire progressivamente il pronto soccorso utilizzando una pinza.

Inizia dalla parte anteriore o permanente e procedi verso l'estremità posteriore. Quindi trasferire pui in una goccia di olio viscoso su un vetrino da microscopio e valutare il campione al microscopio per campioni interi. Usa l'obiettivo Forex o 10 x per mettere a fuoco il campione.

Utilizzando il software del microscopio confocale, regolare la lunghezza d'onda di eccitazione per la proteina fluorescente desiderata per prevenire il fotosbiancamento. Inizia con un'intensità laser dal 5 al 10%Se il segnale è deludente, aumenta l'intensità secondo necessità per migliorare il rapporto segnale/rumore. Per le immagini confocali, abilitare le impostazioni software che calcolano la media delle misurazioni dei pixel da scansioni replicate, come la media di Kalman per i confronti quantitativi dell'attività CRE utilizza la sezione C dove la fluorescenza appare più intensa.

Passa a una tabella di ricerca di avviso di saturazione e regola il guadagno e l'offset della tensione del canale su impostazioni in cui pochi pixel sono saturi. Se necessario, regolare l'apertura confocale. Una volta determinate le impostazioni ottimali, eseguire la scansione ZS per ottenere una serie di immagini lungo l'asse Z.

Al termine della scansione, convertire la pila di immagini in una proiezione e salvare questo file immagine in formato TIF. Per il confronto quantitativo delle attività CRE, utilizzare le stesse impostazioni confocali per tutti i campioni replicati e le linee transgeniche reporter. Per l'esperimento con il programma Image J è iniziato, aprire un'immagine TIFF da valutare.

Fare clic sul pulsante di selezione a mano libera e delineare l'area del campione in cui si desidera la quantificazione. Per ottenere una statistica del valore dei pixel, fare clic sulla scheda Analizza e quindi selezionare misura. Registra il punteggio medio del valore dei pixel dalla casella dei risultati.

Raccogli anche un secondo valore medio di pixel da un'area di sfondo in cui il CRE non è attivo. Per ricavare un valore medio dei pixel modificato, continuare a generare statistiche sul valore dei pixel per i campioni replicati. Quindi, dalla replica, i valori medi dei pixel regolati, determinare l'attività normativa media per A CRE e calcolare anche l'errore standard della media.

Questo esperimento utilizza l'intensità del fenotipo dell'occhio bianco di salvataggio per rendere omozigoti le linee transgeniche. Per l'integrazione del transgene viene utilizzato un background genetico mutante bianco con una sequenza del sito di atterraggio A TTP. Gli individui transgenici, emizigoti e omozigoti per il vettore integrato, si distinguono per l'intensità del fenotipo del colore dell'occhio salvato per il numero di copie del gene mini bianco integrato.

Le linee omozigoti vengono quindi stabilite incrociando mosche maschi e femmine con il fenotipo del colore degli occhi più scuro. I marcatori morfologici vengono utilizzati per determinare lo stadio metamorfico della drosofila durante la metamorfosi da larva a moscerino adulto della frutta. L'esemplare passa attraverso una serie di morfologie stereotipate che possono essere utilizzate per determinare il sesso e approssimare lo stadio di sviluppo. Qui.

Una versione wild type di A CRE, nota come elemento dimorfico, guida alti livelli di espressione reporter di EGFP nel segmento addominale ASIC della femmina. Una sequenza di 13 coppie di basi all'interno di questo CRE è risultata essere un sito di legame per il fattore di trascrizione DSX e l'importanza in vivo di questa sequenza è dimostrata quantificando l'attività regolatoria per il CRE quando questo sito di legame è mutato. Analisi quantitative indicano che la mutazione di questo sito DSX ha ridotto l'attività regolatoria al 28% più o meno del 3% dell'espressione wild type nel contesto del sito di inserzione del transgene qui utilizzato.

Confronti simili valutano le attività regolatorie per gli alleli CRE intra-specifici o tra CRE autologhi di specie separate, ad esempio, rispetto ai livelli di EGFP nel segmento femminile. Un sei, guidato dal ceppo D Melin gastric Canin S, i CRE autologhi per le specie D stimolanti e D willi possiedono attività regolatorie pari a 75 più o meno il 4% e zero più o meno 0% rispettivamente. I seguenti metodi procedurali come l'interferenza dell'RNA possono essere utilizzati con i geni dei fattori di trascrizione per rispondere a ulteriori domande su come questi geni dei fattori di trascrizione interagiscono con gli elementi regolatori di CYS.

Ciò sarebbe indicato dall'aumento e dalla diminuzione dell'espressione della proteina reporter fluorescente che sono guidati dagli elementi regolatori CIS dopo il suo sviluppo. Questa procedura ha spianato la strada ai ricercatori nel campo della regolazione genica per esplorare l'importanza funzionale che i motivi degli elementi regolatori cis e le mutazioni evolute hanno sull'espressione genica.