Confronto quantitativo di Cis-Regulatory Element (CRE) Attività in transgenici Drosophila melanogaster

L'obiettivo generale di questo procedimento è misurare quantitativamente le attività regolatorie geniche di elementi regolatori CIS o CRE attivi durante lo sviluppo metamorfico di Drosophila melanogaster. Iniziare con metodi di integrazione sito-specifica per generare linee di CRE incorporate transgenicamente come transgeni reporter. Utilizzando un microscopio stereoscopico, ottenere campioni transgenici allo stadio di sviluppo corretto.

Rimuovere i campioni dall'ectoprocto esterno e montarli su un microscopio in vetro. Procedere quindi a registrare il livello e il modello di espressione della proteina reporter fluorescente in campioni interi mediante analisi al microscopio confocale. Infine, quantificare il livello di espressione della proteina reporter fluorescente per le immagini confocali registrate utilizzando lo strumento software ImageJ.

Questi risultati attribuiscono un livello di attività regolatoria genica per assistere l'elemento regolatorio e facilitare ulteriori studi comparativi sull'espressione genica riguardo varianti modificate di CRE. Questa procedura può aiutare a rispondere a domande fondamentali e suscitare interesse sulla regolazione genica e sul modo in cui tale regolazione è codificata. Il DNA risulta particolarmente rilevante per la biologia dello sviluppo e l'evoluzione.

Questa procedura è stata sviluppata per fornire informazioni sugli elementi regolatori cis che svolgono la loro funzione durante lo sviluppo metamorfico di Drosophila melanogaster. In linea di principio, tuttavia, può essere applicata anche ad elementi regolatori cis attivi in altre fasi dello sviluppo e in altre specie di moscerini della frutta, o addirittura in altri organismi modello. Per espandere le linee transgeniche, preparare due provette, aggiungendo diverse mosche maschio e femmina ogni due giorni.

Trasferire le mosche da una delle provette in una provetta nuova. Ripetere questa operazione per una settimana. Alla fine di due settimane, verificare che le mosche della frutta transgeniche coprano stadi di sviluppo che vanno da larvale a adulto.

Iniziare a stadiare i campioni alla fine dello stadio larvale di terza instar, quando il reticolo endoplasmatico è formato. Si noti che il campione non è mobile. Il reticolo endoplasmatico è bianco e morbido, e le strutture sferiche hanno perso la specificità, indicando questo punto temporale.

Al tempo zero HAPF. Distinguere i maschi dalle femmine in base alla presenza di gonadi situate bilateralmente vicino al punto medio del corpo, che appaiono come cerchi traslucidi, per lo stadio in base alla lunghezza della metamorfosi. Al tempo zero HAPF, trasferire i campioni in una provetta fresca utilizzando un pennello inumidito.

Aggiungere un pezzo di carta Kimwipe e inumidirlo con acqua per evitare che i campioni si secchino. Incubare quindi il vial a 25 gradi Celsius fino al PFH desiderato. In alternativa, classificare i campioni ordinandoli in base all'identificazione della presenza e della posizione di diversi marcatori morfologici, come descritto nel testo allegato.

Con del nastro da laboratorio, fissare un pezzo di nastro adesivo su una tavola da dissezione con la superficie appiccicosa rivolta verso l'alto. Inumidire un pennello e applicare umidità ai campioni utilizzando un pennello. Trasferire i campioni su un fazzoletto di carta Kim.

Trasferire i campioni sul nastro adesivo e fissarli con la superficie dorsale rivolta verso l'alto. Lasciare asciugare i campioni per 15 minuti. Aprire progressivamente l'ER utilizzando pinzette.

Iniziare dall'estremità anteriore o perma e procedere verso l'estremità posteriore. Trasferire quindi il campione su una goccia di olio viscoso su un vetrino da microscopio e valutare il campione al microscopio per preparati in montaggio totale. Utilizzare l'obiettivo Forex o quello 10x per mettere a fuoco il campione.

Utilizzando il software del microscopio confocale, regolare la lunghezza d'onda di eccitazione per la proteina fluorescente desiderata per prevenire il fotoblesamento. Iniziare con un'intensità del laser compresa tra il 5 e il 10%. Se il segnale risulta debole, aumentare l'intensità secondo necessità per migliorare il rapporto segnale-rumore. Per le immagini confocali, attivare le impostazioni software che effettuano la media delle misurazioni dei pixel provenienti da scansioni ripetute, come la media di Kalman, per confronti quantitativi dell'attività di CRE, utilizzando la sezione C in cui la fluorescenza appare più intensa.

Passare a una tabella di ricerca per l'avviso di saturazione e regolare il guadagno e l'offset della tensione del canale su valori in cui pochi pixel sono saturi. Se necessario, regolare l'apertura confocale. Una volta determinate le impostazioni ottimali, eseguire la scansione ZS per ottenere una serie di immagini lungo l'asse Z.

Al termine della scansione, convertire la serie di immagini in una proiezione e salvare questo file immagine in formato TIF. Per un confronto quantitativo delle attività di CRE, utilizzare le stesse impostazioni confocali per tutti i campioni replicati e le linee di transgeni reporter. Per l'esperimento con il programma ImageJ, aprire un'immagine TIFF da valutare.

Fare clic sul pulsante di selezione a mano libera e delimitare l'area del campione in cui si desidera effettuare la quantificazione. Per ottenere una statistica relativa al valore dei pixel, fare clic sulla scheda analisi e quindi selezionare misura. Registrare il valore medio dei pixel dalla finestra dei risultati.

Raccogli anche un secondo valore medio dei pixel da una regione di fondo in cui il CRE non è attivo. Per ottenere un valore medio corretto dei pixel, continua a generare statistiche sui valori dei pixel per i campioni replicati. Quindi, dai valori medi corretti dei replicati, determina l'attività regolatoria media per un CRE A e calcola anche l'errore standard della media.

In questo esperimento, l'intensità del fenotipo oculare bianco di recupero viene utilizzata per ottenere linee transgeniche omozigoti. Viene impiegato un background genetico mutante del gene white contenente una sequenza sito di atterraggio A TTP per l'integrazione specifica del transgene a livello del sito. Gli individui transgenici, emizigoti e omozigoti per il vettore integrato, vengono distinti in base all'intensità del fenotipo del colore dell'occhio recuperato, determinata dal numero di copie del gene mini white integrato.

Vengono quindi stabilite linee omozigoti incrociando maschi e femmine con il fenotipo del colore dell'occhio più scuro. I marcatori morfologici vengono utilizzati per determinare lo stadio metamorfico di Drosophila durante la metamorfosi da larva a moscerino adulto. Il campione attraversa una serie di morfologie stereotipate che possono essere utilizzate per determinare il sesso e stimare lo stadio di sviluppo. Qui.

Una versione wild type di un CRE, denominato elemento dimorfico, induce alti livelli di espressione del reporter EGFP nel segmento addominale ASIC del puy femmina. All'interno di questo CRE è stata identificata una sequenza di 13 paia di basi che costituisce un sito di legame per il fattore di trascrizione DSX, e l'importanza in vivo di questa sequenza è dimostrata quantificando l'attività regolatoria del CRE quando questo sito di legame è mutato. Le analisi quantitative indicano che la mutazione di questo sito DSX riduce l'attività regolatoria al 28 più o meno 3% dell'espressione wild type nel contesto del sito di inserzione del transgene utilizzato in questo caso.

Confronti simili valutano le attività regolatorie di alleli CRE intra-specifici o tra CRE autoctoni di specie diverse, ad esempio rispetto ai livelli di EGFP nel segmento femminile. Un esperimento condotto mediante i CRE autoctoni della ceppia D Melin gastric Canin S mostra che le attività regolatorie per le specie D stimulants e D willi sono pari rispettivamente a 75 più o meno 4% e a 0 più o meno 0%. Metodi successivi, come l'interferenza dell'RNA, possono essere utilizzati con geni di fattori di trascrizione per rispondere ad ulteriori domande su come questi geni di fattori di trascrizione interagiscono con elementi regolatori CYS.

Ciò sarebbe indicato dall'aumento e dalla diminuzione dell'espressione della proteina reporter fluorescente, regolata da elementi regolatori CIS dopo il loro sviluppo. Questa procedura ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della regolazione genica per esplorare l'importanza funzionale dei motivi degli elementi regolatori cis e delle mutazioni evolutive sull'espressione genica.