Name: Confronto quantitativo di Cis-Regulatory Element (CRE) Attività in transgenici Drosophila melanogaster /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-19T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Scopri come misurare quantitativamente l'attività dei CRE in Drosophila melanogaster durante lo sviluppo metamorfico. Questo metodo utilizza linee transgeniche con reporter fluorescenti e microscopia confocale per analizzare i pattern di espressione genica.

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Ringraziamo: Nicolas Gompel e Benjamin Prud&#39;homme per il loro contributo allo sviluppo di questo protocollo, Melissa Williams e quattro revisori anonimi per i commenti sul manoscritto, l&#39;Università di Dayton Scuola di specializzazione per borse di ricerca in WAR, e la University of Dayton Biologia Dipartimento e Research Institute (UDRI) per sostenere la ricerca per TMW. Questo lavoro è stato sostenuto dalla American Heart Association Concessione 11BGIA7280000 a TMW.

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Non abbiamo nulla da rivelare.

cis-normativo elementi di codificare il programma genomico che specifica gli schemi di espressione genica e quindi il processo di sviluppo 1, e sono luoghi importanti per entrambe le mutazioni alla base dell&#39;evoluzione morfologica 2-4 e variazione fenotipica di tratti umani 5,6,19. A dispetto di questa importanza, la logica di regolamentazione per CRES sono ancora limitate. Una ragione importante per comprendere questo deficit è stata la mancanza di metodi adeguati per confr...

confronto quantitativo di cis-regulatory element (cre) attività in transgenici drosophila melanogaster</em

Quantitative Comparison of cis-Regulatory Element (CRE) Activities in Transgenic Drosophila melanogaster

Schemi di espressione genica sono specificati dal cis-regolamentazione elemento (CRE) sequenze, che sono anche chiamati esaltatori o cis-regolamentazione moduli. Un tipico CRE possiede un accordo di siti di legame per il fattore di trascrizione diverse proteine ​​che conferiscono una logica regolamentare specificando quando, dove ea quale livello del gene regolamentati (s) è espresso. Il set completo di CRES all&#39;interno di un programma di codifica del genoma animale dell&#39;organismo per lo sviluppo 1, ed empirica come pure studi teorici indicano che mutazioni a Cres svolto un ruolo preminente nella evoluzione morfologica 2-4. Inoltre, gli studi del genoma umano gamma di associazione indicano che la variazione genetica a Cres contribuire in modo sostanziale alla variazione fenotipica 5,6. Così, la comprensione logica regolamentare e di come le mutazioni influenzano tale logica è un obiettivo centrale della genetica. Transgeni reporter di fornire un metodo efficace per studiare in vivo la funzionezione di Cres. Ecco una sequenza di note o sospette CRE è accoppiato ad promotore eterologo e sequenze che codificano per un gene reporter codifica per una proteina prodotta facilmente osservabili. Quando un giornalista transgene si inserisce in un organismo ospite, l&#39;attività del CRE diventa visibile sotto forma della proteina codificata giornalista. P-elemento transgenesi mediata nella specie di moscerino della frutta Drosophila (D.) melanogaster 7 è stato utilizzato per decenni per introdurre transgeni giornalista in questo organismo modello, anche se la collocazione genomica dei transgeni è casuale. Quindi, l&#39;attività del gene reporter è fortemente influenzato dalla cromatina locale e l&#39;ambiente gene, limitando confronti CRE di essere qualitativa. Negli ultimi anni, il sistema di integrazione basato phiC31 è stato adattato per l&#39;uso in D. melanogaster per inserire transgeni in specifici siti del genoma di atterraggio 10/08. Questa capacità ha reso la misurazione quantitativa del gene e, qui interessa, l&#39;attività CRE 11-13 feasible. La produzione di moscerini della frutta transgenica possono essere esternalizzate, tra cui phiC31 a base di integrazione, eliminando la necessità di acquistare costose attrezzature e / o competenza specialistica a protocolli di iniezione transgene. Qui vi presentiamo un protocollo generale per valutare quantitativamente un CRE l&#39;attività, e mostrare come questo approccio può essere utilizzato per misurare gli effetti di una mutazione introdotta l&#39;attività di un CRE e confrontare le attività del CRES ortologhi. Anche se gli esempi riportati sono per un attivo CRE durante metamorfosi moscerino della frutta, l&#39;approccio può essere applicato ad altre fasi di sviluppo, specie di moscerino della frutta, o di organismi modello. In definitiva, un uso più diffuso di questo approccio a Cres studio dovrebbe avanzare la comprensione della logica normativa e come logica può variare ed evolvere.

Variazione fenotipica per i tratti può derivare da mutazioni in cis-regolamentazione elemento (CRE) sequenze che i modelli di espressione genica di controllo. Metodi derivati ​​per l&#39;utilizzo in Drosophila melanogaster possono confrontare quantitativamente i livelli di modelli spaziali e temporali di espressione genica mediata da modificato o naturale varianti CRE.

Confronto quantitativo di Cis-Regulatory Element (CRE) Attività in transgenici Drosophila melanogaster</em

I modelli di espressione genica sono specificati dalle sequenze degli elementi cis-regolatori (CRE), detti anche enhancer o moduli cis-regolatori. Un tipico CRE...

L'obiettivo generale di questo procedimento è misurare quantitativamente le attività regolatorie geniche di elementi regolatori CIS o CRE attivi durante lo sviluppo metamorfico di Drosophila melanogaster. Iniziare con metodi di integrazione sito-specifica per generare linee di CRE incorporate transgenicamente come transgeni reporter. Utilizzando un microscopio stereoscopico, ottenere campioni transgenici allo stadio di sviluppo corretto.Rimuovere i campioni dall'ectoprocto esterno e montarli su un microscopio in vetro. Procedere quindi a registrare il livello e il modello di espressione della proteina reporter fluorescente in campioni interi mediante analisi al microscopio confocale. Infine, quantificare il livello di espressione della proteina reporter fluorescente per le immagini confocali registrate utilizzando lo strumento software ImageJ.Questi risultati attribuiscono un livello di attività regolatoria genica per assistere l'elemento regolatorio e facilitare ulteriori studi comparativi sull'espressione genica riguardo varianti modificate di CRE. Questa procedura può aiutare a rispondere a domande fondamentali e suscitare interesse sulla regolazione genica e sul modo in cui tal

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In questo lavoro forniamo un flusso di lavoro sperimentale su come i potenziatori attivi possono essere identificati e convalidati sperimentalmente.

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Il<em&gt; Drosophila</em&gt; Immaginale Disc tumore Modello: visualizzazione e la quantificazione di espressione genica e di Tumor invasività Utilizzando genetica Mosaici

Regolamento dell'ambiente della cromatina è un processo essenziale necessario per l'espressione genica corretto. Qui, descriviamo un metodo per il controllo dell'espressione genica attraverso il reclutamento di modificante la cromatina macchinari in modo gene-specifico e reversibile.

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Confronto quantitativo di Cis-Regulatory Element (CRE) Attività in transgenici Drosophila melanogaster

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