Una pipeline computazionale per la quantificazione dell'RNA dell'enhancer intergenico/intragenico nelle cellule staminali embrionali di topo

Il nostro gruppo studia l'epigenetica e l'epitrastrastomica degli enhancer, concentrandosi sullo sviluppo di metodi accurati per quantificare gli RNA degli enhancer come indicatori di attivazione degli enhancer. Poiché gli esaltatori intragenici erano con i trascrivi ospiti, distinguere i segnali DER degli enhancer e quantificarli con precisione è una sfida. Per iniziare, aprire il terminale e digitare il comando per preparare i file e i riferimenti necessari per l'identificazione dell'enhancer.

Digita il comando nel terminale per entrare nella directory di lavoro. Poi esegui il comando che copia gli script di identificazione degli enhancer nella directory corrente. Poi esegui il comando corrispondente per generare file BED per regioni promotrici, corpi genici e geni codificanti per proteine usando l'annotazione del codice gen.

Preparare i file ATAC-seq e ChIP-seq degli istoni per l'identificazione degli enhancer. Inserisci il comando di pre-elaborazione appropriato nel terminale. Successivamente, esegui il comando per definire e classificare gli esaltatori usando i dati di picco della cromatina.

Digita il comando per assegnare le informazioni temporanee del filamento al file BED dell'amplificatore intergenico. Successivamente, inserisci il comando per determinare la direzione corretta dei filamenti per gli potenziatori intergenici che si sovrappongono ai geni presenti su entrambi i fili. Successivamente, calcola RPKM specifica per i geni che si sovrappongono agli potenziatori dello stesso filamento.

Poi entra il comando per finalizzare l'assegnazione dei filamenti per gli potenziatori intergenici. Assegnare le informazioni finali sul filo a tutti gli potenziatori intergenici e alle rispettive regioni di cima. Digita il comando nel terminale per spostarlo nella directory radice della pipeline.

Successivamente utilizzare il comando appropriato per copiare lo script per preparare l'analisi a valle. Utilizzando il comando appropriato, preparare tutti i file necessari per l'aggregazione degli enhancer, l'elaborazione del segnale GRO-seq e la quantificazione dell'RNA degli enhancer. Successivamente, digita lo script per inserire la directory di lavoro e poi copia gli script necessari per l'analisi a valle. Creare grafici di aggregazione, mostrando i modelli dei segnali della cromatina attorno a ogni tipo di cima potenziante.

Digita il comando corrispondente nel terminale. Una volta che il prompt ritorna, inserisci il comando per quantificare i livelli di espressione dell'RNA potenziatore da GRO-seq usando il conteggio delle caratteristiche. Infine, esegui lo script per visualizzare e confrontare i livelli di espressione dell'RNA degli enhancer tra i gruppi di enhancer utilizzando R.In dataset GRO-seq.

Le code polinucleotidiche erano presenti prima del taglio e rimosse con successo dopo l'applicazione dei dataset ATAC-seq di fine compromesso dei parametri di ritagli Le sequenze degli adattatori NextEra sono state rilevate in entrambe le coppie rosse prima del taglio e rimosse dopo la pre-elaborazione dei set di dati ChIP-seq per l'acetilazione H3K27 che hanno mostrato una contaminazione minima da adattatori richiedendo solo il taglio predefinito. Il filtraggio dei dati ATAC-seq ha prodotto 71.165 regioni di cromatina aperta non motorie, che includevano 47.317 regioni di potenziamento, di cui 23.147 classificate come attive e 24.170 come non attive basate sulla sovrapposizione con i segni degli istoni; tra tutte le regioni di potenziamento il 45,2% era intergenico e il 54,8% intragenico. Questa distribuzione era simile tra le categorie di potenziatori non attivi e attivi.

Un potenziatore intergenico a monte del gene NENO ha mostrato un forte arricchimento per ATAC-seq, monometilazione H3K4, acetilazione H3K27 e segnali GRO-seq. Un potenziatore intragenico vicino al gene CHD2 ha mostrato caratteristiche simili alla cromatina e alla trascrizione NENOG con segnali chiari in tutti e quattro i set di dati. I grafici di aggregazione hanno mostrato che gli potenziatori attivi avevano un arricchimento coordinato di segnali di ATAC-seq, monometile H3K4 e acetilazione H3K27.

Mentre gli esaltatori non attivi mancavano di arricchimento di acetilazione H3K27, ma mantenevano forti segnali ATAC-seq e H3K4 monometilici. Gli enhancer attivi hanno mostrato una trascrizione derivata da GRO-seq significativamente più alta rispetto a quelli non attivi sia nelle regioni intergeniche che intrageniche. Assembliamo quelle pipeline di calcolo eRNA consapevoli delle tendenze validate tramite trascrizione dipendente dall'attività in contesti intergenici o intragenici.

Affrontiamo la DER di una quantificazione standardizzata e accessibile dell'eRNA, specialmente per potenziatori intragenici confusi dal genoma ospite. Rivedremo l'identificazione autoguidata, separeremo i trascrizioni operative sia dalle tendenze sia dalla pipeline di analisi dei benchmark tra assemblaggi genomici, protocolli sperimentali e tipi cellulari.