Previsione e Validazione del gene regolatore elementi attivato durante retinoico Acid Induced embrionali cellule staminali Differenziazione

L'obiettivo generale di questo video è fornire un insieme integrato di metodi per identificare e validare sperimentalmente elementi regolatori genomici, detti enhancer. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla trascrizione e regolazione di eventi biologici, inclusa la selezione e l'utilizzo di enhancer, durante la differenziazione cellulare o in risposta a stimoli esterni. Il principale vantaggio del flusso di lavoro presentato è che il protocollo può essere facilmente adattato e utilizzato in qualsiasi sistema modello cellulare.

Illustrerò i passaggi della procedura. Per iniziare, scegliere un enhancer candidato in base ad un'analisi preesistente di chip seq. Utilizzare un browser genomico per visualizzare i risultati dell'esperimento di chip seq desiderato e identificare i siti di legame in prossimità del gene di interesse.

Scegliere "Definire una regione di interesse" per ottenere una sequenza di 200-400 paia di basi della regione genomica selezionata e utilizzare le sequenze per la progettazione successiva dei primer. Mediante tecniche standard di biologia molecolare, amplificare e clonare la regione genomica selezionata in un costrutto plasmidico reporter. Per verificare l'attività enhancer, trasfettare i costrutti reporter in cellule staminali embrionali massive aggiungendo prima 200 microlitri di soluzione di gelatina allo 0,1% per pozzetto in piastre a 48 pozzetti.

Incubare le piastre per 30 minuti prima della semina. Il giorno precedente la trasfezione, seminare cellule staminali embrionali, o cellule ES, senza feeder, in 250 µL di mezzo ES a una densità di 3 × 10⁴ cellule per pozzetto. Nel giorno della trasfezione, preparare le miscele di plasmidi, preparandone una quantità sufficiente per otto pozzetti per ogni miscela.

Aggiungere mezzo di coltura con siero ridotto di qualità per trasfezione a ciascuna miscela di plasmidi per portare il volume a 106 microlitri. Successivamente, aggiungere 4,5 microlitri di reagente di trasfezione di qualità ES e mescolare accuratamente aspirando e dispensando 15 volte su e giù con la pipetta. Incubare la miscela di trasfezione per 15 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, aggiungere 13 microlitri per pozzetto del mix di trasfezione alle cellule e mescolare accuratamente mediante pipettaggio. Successivamente, riposizionare le cellule nell'incubatore per tutta la notte prima del trattamento con il liquene. L'efficienza di trasfezione è una fase critica.

Se viene utilizzato un altro tipo di cellula, questo passaggio richiede un'ottimizzazione. Utilizzare il tipo di cellula più pertinente per testare l'attività dell'enhancer al fine di ridurre al minimo gli effetti dipendenti dal contesto. Il giorno successivo, rimuovere con attenzione il mezzo per aspirazione e aggiungere 250 µL di mezzo fresco per pozzetto contenente un micro molar di acido retinoico all-trans o DMSO come veicolo.

Incubare le cellule per 24-48 ore. Dopo aver preparato il buffer di lisi secondo il protocollo indicato nel testo, aspirare con attenzione il mezzo dalle cellule. Lavare le cellule una volta con PBS 1X, quindi aggiungere 200 microlitri di buffer di lisi 1X per ogni pozzetto.

Agitare le cellule a temperatura ambiente per due ore. Successivamente, per una lisi cellulare completa, congelare i lisati cellulari nella piastra a 80 gradi Celsius. Dopo aver completamente scongelato i lisati, utilizzare una pipetta elettronica multicanale per trasferire 80 microlitri del lisato cellulare in una piastra trasparente a 96 pozzetti per il saggio di beta-galattosidasi e 40 microlitri del lisato in una piastra bianca per la misurazione della luciferasi.

Per eseguire il saggio della beta-galattosidasi, mescolare un millilitro del tampone substrato beta-gal con quattro milligrammi di OMPG. Quindi, aggiungere 3,5 microlitri di beta-mercaptoetanolo alla miscela e immediatamente aggiungere 100 microlitri del tampone a 80 microlitri di lisato cellulare. Incubare le reazioni a 37 gradi Celsius fino a quando non si sviluppa un colore giallo tenue.

Leggere l'assorbanza a 420 nanometri su un lettore di piastre ed esportare i dati. Per eseguire il saggio di luciferasi, dopo aver preparato il reagente substrato seguendo il protocollo indicato nel testo, portare il reagente substrato per luciferasi a temperatura ambiente prima di iniziare. Quindi, pipettare 100 microlitri in ciascun pozzetto della piastra bianca contenente 40 microlitri di lisato cellulare.

Utilizzare immediatamente una macchina contatore luminiscente per misurare il segnale. Ottenere i valori di attività da almeno tre trasfezioni ed esperimenti indipendenti. Eseguire i calcoli per entrambi i saggi secondo il protocollo descritto nel testo.

Per progettare i primer per il rilevamento di eRNA mediante RT-PCR, selezionare una regione genomica distante almeno da 1,5 a due chilobasi da qualsiasi trascritto genico annotato. Identificare la direzione relativa del gene e determinare la posizione dei trascritti senso e antisenso. Per progettare i primer per la quantificazione dell'RNA enhancer, scegliere regioni distanti da 200 a 1.000 paia di basi dal centro del sito di legame del fattore di trascrizione.

Se il gene si trova sul filamento negativo, copiare 200-300 paia di basi del filamento positivo e convertire la sequenza per ottenere la sequenza complementare inversa. Successivamente, utilizzare questa sequenza per la progettazione dei primer. Impostare l'intervallo della dimensione del prodotto tra 80-150 paia di basi.

Per misurare la trascrizione di eRNA, dopo aver isolato l'RNA totale da cellule trattate seguendo il protocollo descritto nel testo, rilevare l'eRNA retrotrascritto mediante RTCPR utilizzando una procedura standard. Misurare un mRNA indipendente dal trattamento per la normalizzazione. Come mostrato qui, l'analisi bioinformatica dei dati di sequenziamento RXR ottenuti da cellule ES trattate con acido retinoico ha rivelato l'arricchimento del sito semi-nucleare recettoriale nei siti occupati da RXR.

Utilizzando un algoritmo di bioinformatica, i risultati della ricerca del motivo per il sito semplificato sono stati mappati nuovamente sui dati di sequenziamento chip per RXR. Questa analisi ha identificato picchi del chip che si sovrappongono a siti di legame canonici del recettore nucleare. La visualizzazione dei siti in IGV ha indicato un arricchimento dei fattori di trascrizione nelle vicinanze di Hoxa1.

Un bersaglio RAR-RXR precedentemente caratterizzato. È stato inoltre identificato un enhancer potenziatore per una nuova catena bersaglio dell'acido retinoico, PRMT8. Le regioni enhancer identificate sono state clonate nel vettore reporter di luciferasi TK e le cellule staminali embrionali sono state trasfettate con questi costrutti.

L'attività della luciferasi è stata misurata in assenza e in presenza di RA. I costrutti contenenti l'elemento di risposta alla RA, o RARE, hanno mostrato un aumento dell'intensità del segnale della luciferasi dopo il trattamento con RA, mentre il costrutto privo del RARE non è stato indotto. Per accertare se l'espressione in senso diretto e inverso dell'eRNA dell'enhancer legato a RAR RXR di Hoxa1 correla con l'espressione dell'mRNA del gene, è stato misurato anche il livello di eRNA di Hoxa1. I risultati hanno confermato che l'attività dell'enhancer è indotta da un trattamento a breve termine con RA.

Una volta acquisita padronanza, questo carico di lavoro può essere completato in pochi giorni eseguendo l'esperimento di trappola dell'amplificatore descritto e la quantificazione dell'amplificatore; in questo modo si può fornire una solida evidenza funzionale dell'attività amplificatrice. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come identificare e caratterizzare gli amplificatori punitivi. Una volta identificato e convalidato un amplificatore, possono essere eseguiti altri metodi, come la cattura della conformazione cromosomica, o CCC, al fine di rispondere ad altre domande importanti, ad esempio a quale gene è regolato dall'amplificatore convalidato?