Previsione e Validazione del gene regolatore elementi attivato durante retinoico Acid Induced embrionali cellule staminali Differenziazione

L'obiettivo generale di questo video è quello di fornire un insieme integrato di metodi per identificare e convalidare sperimentalmente gli elementi regolatori geneomici, i cosiddetti enhancer. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella trascrizione e nella regolazione di eventi biologici, tra cui la selezione e l'uso di potenziatori, l'uso della differenziazione cellulare o in risposta a stimoli esterni. Il vantaggio principale del flusso di lavoro presentato è che un protocollo può essere facilmente adattato e utilizzato in qualsiasi sistema modello cellulare.

Illustrerò le fasi della procedura. Per iniziare, scegli un potenziatore candidato in base all'analisi del seq del chip preesistente. Utilizzare un browser genomico per visualizzare i risultati dell'esperimento di chip seq desiderato e identificare i siti di legame in prossimità del gene di interesse.

Scegliete Definisci una regione di interesse per ottenere una sequenza di 200-400 coppie di basi della regione genomica selezionata e utilizzate le sequenze per la successiva progettazione del primer. Con le tecniche standard di biologia molecolare, è possibile amplificare e clonare la regione genomica selezionata in un costrutto plasmidico reporter. Per testare l'attività dell'enhancer, trasfettare i costrutti reporter in cellule staminali embrionali di massa aggiungendo prima 200 microlitri di soluzione di gelatina allo 0,1% per pozzetto a piastre da 48 pozzetti.

Incubare le piastre per 30 minuti prima di procedere alla piastratura. Il giorno prima della trasfezione, le cellule staminali embrionali prive di alimentatori a piastre, o cellule ES, in 250 microlitri di terreno ES a una densità di tre volte 10 per le quarte cellule per pozzetto. Il giorno della trasfezione, preparare le miscele di plasmidi, rendendole sufficienti per otto pozzetti da ciascuna miscela.

Aggiungere il terreno di siero ridotto di qualità di trasfezione a ciascuna miscela di plasmidi per portare il volume fino a 106 microlitri. Quindi, aggiungere 4,5 microlitri di reagente di trasfezione di qualità ES e mescolare accuratamente pipettando 15 volte su e giù. Incubare la miscela di trasfezione per 15 minuti a temperatura ambiente.

Dopo l'incubazione, aggiungere 13 microlitri per pozzetto della miscela di trasfezione alle cellule e mescolare accuratamente pipettando. Quindi, riposizionare le cellule nell'incubatrice durante la notte prima del trattamento con i licheni. L'efficienza della trasfezione è un passaggio critico.

Se viene utilizzato un altro tipo di cella, questo passaggio richiede l'ottimizzazione. Utilizzare il tipo di cellula più rilevante per testare l'attività del potenziatore per ridurre al minimo gli effetti dipendenti dal contesto. Il giorno seguente, rimuovere con cura il terreno mediante aspirazione e aggiungere 250 microlitri di terreno fresco per pozzetto contenente un micro molare di acido transretinoico, o DMSO come veicolo.

Incubare le cellule per 24-48 ore. Dopo aver preparato il tampone di lisi secondo il protocollo di testo, aspirare con cura il terreno dalle cellule. Utilizzare 1X PBS per far lievitare le cellule una volta, quindi aggiungere 200 microlitri di tampone di lisi 1X per pozzetto.

Agitare le celle a temperatura ambiente per due ore. Quindi, per una lisi cellulare completa, congelare i lisati cellulari nella piastra a 80 gradi Celsius. Dopo aver scongelato completamente i lisati, utilizzare una pipetta elettronica multicanale per trasferire 80 microlitri di lisato cellulare su una piastra trasparente a 96 pozzetti per la beta galattosidasi e 40 microlitri di lisato su una piastra bianca per la misurazione della luciferasi.

Per effettuare la beta galattosidasi, mescolare un millilitro del tampone del substrato beta gal con quattro milligrammi di OMPG. Quindi, aggiungere 3,5 microlitri di beta mercaptoetanolo alla miscela e aggiungere immediatamente 100 microlitri di tampone agli 80 microlitri di lisato cellulare. Incubare le reazioni a 37 gradi Celsius fino a quando non si sviluppa il colore giallo tenue.

Leggere l'assorbanza a 420 nanometri su un lettore di piastre ed esportare i dati. Per eseguire il test della luciferasi, dopo aver preparato il reagente del substrato secondo il protocollo di testo, riscaldare il reagente del substrato della luciferasi a temperatura ambiente prima di iniziare. Quindi, versare 100 micro litri in ciascun pozzetto della piastra bianca contenente i 40 micro litri di lisato cellulare.

Utilizzare immediatamente un contatore luminescente per misurare il segnale. Ottieni le attività da almeno tre trasfezioni ed esperimenti indipendenti. Eseguire i calcoli per entrambi i saggi secondo il protocollo di testo.

Per progettare i primer per la rilevazione di eRNA mediante RTCPR, selezionare una regione genomica che si trovi ad almeno 1,5-2 kilo di basi di distanza da qualsiasi trascrizione genica annotata. Identificare la direzione relativa del gene e determinare la posizione dei trascritti senso e antisenso. Per progettare primer per la quantificazione dell'RNA dell'enhancer, scegliere le regioni 200-1.000 paia di basi dal centro del sito di legame del fattore di trascrizione.

Se il gene si trova sul filamento meno, copiare 200-300 paia di basi del filamento positivo e convertire la sequenza per ottenere la sequenza inversa del complemento. Quindi, utilizzare questa sequenza per la successiva progettazione del primer. Impostare l'intervallo di dimensioni del prodotto tra 80-150 paia di basi.

Per misurare la trascrizione dell'eRNA, dopo aver isolato l'RNA totale dalle cellule trattate secondo il protocollo di testo, rilevare l'eRNA trascritto inversamente mediante RTCPR utilizzando una procedura standard. Misurare un mRNA non dipendente dal trattamento per la normalizzazione. Come mostrato qui, l'analisi bioinformatica dei dati del seq del chip RXR ottenuti da cellule ES trattate con acido retinoico ha rivelato l'arricchimento del semisito del recettore nucleare sotto i siti occupati da RXR.

Utilizzando un algoritmo bioinformatico, i risultati della ricerca del motivo per il mezzo sito sono stati mappati sui dati del seq del chip RXR. Questa analisi ha identificato picchi di chip che si sovrappongono ai siti di legame canonici dei recettori nucleari. La visualizzazione dei siti in IGV ha indicato un arricchimento dei fattori di trascrizione vicino a Hoxa1.

Un target RAR RXR precedentemente caratterizzato. È stato inoltre identificato un potenziatore punitivo per una nuova catena bersaglio dell'artrite reumatoide, PRMT8. Le regioni enhancer identificate sono state clonate nel vettore reporter della luciferasi TK e le cellule ES sono state trasfettate con questi costrutti.

L'attività della luciferasi è stata misurata in assenza e presenza di AR. I costrutti contenenti l'elemento di risposta RA, o RARE, hanno mostrato un aumento dell'intensità del segnale della luciferasi durante il trattamento con AR, mentre il costrutto senza il RARE non è stato indotto. Per accertare se l'espressione dell'eRNA senso e antisenso dell'enhancer legato a RXR Hoxa1 è correlata con l'espressione dell'mRNA del gene, è stato misurato anche il livello di eRNA Hoxa1. I risultati hanno confermato che l'attività dell'enhancer è indotta da un trattamento a breve termine con AR.

Una volta padroneggiato, questo carico di lavoro può essere svolto in pochi giorni eseguendo l'esperimento descritto della trappola dell'enhancer e la quantificazione dell'enhancer, si può fornire una forte evidenza funzionale dell'attività dell'enhancer. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come identificare e caratterizzare i potenziatori punitivi. Una volta che un enhancer è stato identificato e convalidato, è possibile eseguire altri metodi, come la cattura di conferma cromosomica o CCC, per rispondere a ulteriori importanti domande, come ad esempio quale gene è regolato dall'enhancer convalidato?