Name: Previsione e Validazione del gene regolatore elementi attivato durante retinoico Acid Induced embrionali cellule staminali Differenziazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Scopri un flusso di lavoro integrato per identificare e validare sperimentalmente elementi regolatori genomici chiamati enhancer. Questo metodo utilizza analisi ChIP-seq e sistemi cellulari per studiare la regolazione della trascrizione.

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Gli autori ringraziano il Dr. Bence Daniel, Matt Peloquin, il Dr. Endre Barta, il Dr. Balint L Balint e i membri del laboratorio Nagy per le discussioni e i commenti sul manoscritto. L.N è sostenuto da sovvenzioni del Fondo ungherese per la ricerca scientifica (OTKA K100196 e K111941) e cofinanziato dal Fondo sociale europeo e dal Fondo europeo di sviluppo regionale e dal Programma ungherese di ricerca sul cervello - Sovvenzione n. KTIA_13_NAP-A-I/9.

1. Enhancer selezione basata su analisi Chip-Seq <ol><li> Scaricare il file di dati grezzi FASTQ RXR ChIP-Seq (mm_ES_RXR_24h_ATRA.fastq.gz) da http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ </li><li> Scaricare ed estrarre il file di indice BWA necessario per l&#39;allineamento (nel nostro caso: Mus_musculus_UCSC_mm10).(ftp://igenome:G3nom3s4u@ussd-ftp.illumina.com/Mus_musculus/UCSC/mm10/Mus_musculus_UCSC_mm10.tar.gz NOTA: Visita a https://github.com/ahorvath/Bioinformatics_scripts per ulteriori informazioni per quanto riguarda le fasi di analisi bioinformatica e per scaricare gli script usati di seguito. </li><li> Allineare il file di esempio FASTQ al genoma MM10 (utilizzare lo script: perform_alignment.sh). Questo creerà una cartella con un file .bam e le statistiche del tracciato. RXR ChIP-Seq dati allineati (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam), e il file di indice corrispondente (.bai) sono disponibili qui: http://ngsdebftp.med.unideb.hu/bioinformatics/ NOTA: BWA è un pacchetto software che si allinea relasequenze relativamente brevi (ad esempio, risultati ChIP-seq) ad un database di sequenze, come il genoma di riferimento del mouse (ad esempio, mm10) 13. </li><li> Eseguire lo script (callpeaks.sh) per il picco di chiamata e de novo analisi motivo. Utilizzare il file .bam come ingresso. Lo script si basa su Homer findPeaks 14. NOTA: I file di output ci danno informazioni sul numero totale dei picchi, l&#39;arricchimento dei motivi, la percentuale dello sfondo, e le sequenze bersaglio con motivi, ecc. (Figura 1). Tipicamente diversi motivi sono elencati in ordine del loro significato. </li><li> Rimappare il # 1 motivo classificato (NR metà `AGGTCA`) (utilizzare lo script: remap_motif.sh) NOTA: Come risultato, lo script genera un file .bed che mostrerà quale chip-picchi coprono regioni genomiche che contengono il sito di legame canonica del fattore di trascrizione di interesse. </li><li> Scaricare e visualizzare i risultati della allineato RXR ChIP-Seq legge (mm_ES_RXR_24h_ATRA.bam (anche scaricare il .bai)) e le occorrenze motivo AGGTCA (mm_ES_RXR_24h_ATRA_homerpeaks_motif1_mm10s_200_remaped_mbed.bed) da Integrativa Genomica Viewer (IGV) 15 per identificare RAR putativo / RXR siti di legame (Figura 2 e Figura 3). NOTA: L&#39;integrazione di vari dati del chip-ss aiuterà a più prevedere con precisione le buone esaltatori di candidati 16,17. Recenti studi hanno rivelato che esaltatori attivi sono in genere arricchito da P300 e correlazione con H3K4me1 e H3K27ac, e si trovano in regioni della cromatina aperta, mostrando in tal modo DNase-I ipersensibilità è anche raccomandato 18-21. </li><li> Utilizzare la &quot;Definizione di una regione di interesse&quot; in IGV 15 per ottenere 200-400 sequenza bp della regione genomica selezionata e utilizzare queste sequenze per le successive disegni di primer. </li></ol> 2. Reporter Assay NOTA: Il sistema luciferina / luciferasi viene utilizzatocome un saggio giornalista molto sensibile per la regolazione trascrizionale. A seconda della luciferasi enzimatica enhancer è prodotta che catalizzare l&#39;ossidazione di luciferina per oxyluciferin conseguente bioluminescense, che può essere rilevato. Come primo passo, identificate sequenze enhancer putativi dovrebbero essere subclonati in un vettore giornalista (ad esempio, TK-luciferasi 22, pGL3 o NanoLuc). <ol><li> disegno Primer <ol><li> Primer design PCR per l&#39;amplificazione di 200-400 bp di regioni enhancer putativi da Primer3 (disponibile qui: http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 </li><li> Copia-incolla la sequenza genomica da IGV che include il sito di legame putativo in Primer3 (vedi punto 1.7). Set gamma di dimensioni prodotto da 250-300 bp Primer3. </li><li> Convalida i primer PCR utilizzando il browser UCSC genoma di In silico strumento PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) 24 NOTA: Questo protocollo in un passaggio successivo utilizza HindIII e BamHI enzimi di restrizione per la clonazione. Controllare se la PCR sequenza amplificata come previsto dallo strumento PCR UCSC in silico conterrà AAGCTT o GGATCC siti di restrizione (ad esempio, http://nc2.neb.com/NEBcutter2/). </li><li> Ottenere i primer richiesti da un fornitore commerciale. </li></ol></li><li> PCR amplificazione di Enhancer sequenza da DNA genomico <ol><li> Purificare modello DNA genomico da cellule primarie (ad esempio, fibroblasti embrionali primari). Utilizzare kit commerciale per l&#39;isolamento gDNA e seguire le istruzioni del produttore. NOTA: L&#39;alta qualità di gDNA è essenziale per l&#39;amplificazione PCR di successo. Appropriate cloni BAC possono essere utilizzati se la PCR non è facile da gDNA. </li><li> Preparare 50 microlitri reazione PCR contenente 100 ng gDNA, 5 ml 10x tampone, 3 ml MgSO 4 (25 mm), 5 ml dNTP (2 mm ciascuno), 1,5 ml Fwd Primer (10 micron), 1,5 ml Rev Primer (10 micron) , 1 microlitri DNA polimerasi <li> Impostare il ciclo di PCR (2 min 95 ° C, (20 sec a 95 ° C, 10 sec 58 - 65 ° C, 18 sec a 70 ° C) ripetizione x25, 2 min a 70 ° C, sempre 4 ° C). Impostare la temperatura di ricottura con la considerazione del primer del predetto valori Tm. </li><li> Purificare il prodotto di PCR con un kit commerciale di purificazione PCR e seguire le istruzioni del produttore. </li><li> Introdurre i siti di restrizione per la clonazione ripetendo la PCR con primer usati in precedenza, ma l&#39;aggiunta di sporgenze sulle loro estremità 5 &#39;(ad esempio, Fwd: 5&#39;-ATAT AAGCTT xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx-3&#39; (HindIII), Rev: 5&#39;-TATA GGATCC xxxxxxxxxxxxxxxxxxxx -3 &#39;(BamHI)). </li><li> Eseguire 5 ml di prodotto di PCR su gel di agarosio per verificare la presenza di prodotti di PCR aspecifici. NOTA: Se vengono rilevati più bande, eseguire l&#39;intero prodotto PCR e purificare la banda appropriata da un kit di estrazione del gel commerciale. </li></ol&gt; </li><li> Limitazione NOTA: Per clonare inserto a monte della TK promotore 22 il prodotto purificato PCR e il vettore (ad esempio, TK-Luc) deve essere digerito con HindIII e BamHI. <ol><li> Preparare una miscela di reazione di 50 ml contenente 1 mg di prodotto purificato PCR, 1 HindIII microlitri (20 U / mL), 1 ml BamHI (20 U / ml) e 5 ml 10x tampone. </li><li> Preparare una 250 miscela di reazione microlitri contenente vettore 5 mcg (TK Luc, o un vettore giornalista alternativo), 5 ml HindIII (20 U / ml), 5 ml BamHI (20 U / ml), 5 ml termosensibile fosfatasi alcalina (1 U / ml) e 25 microlitri 10x tampone. NOTA: Trattamento AP del vettore diminuisce notevolmente l&#39;auto-ligazione del singolo vettore digerito e quindi lo sfondo. </li><li> Incubare le miscele di reazione per 4 ore a 37 ° C, quindi purificare i prodotti di PCR digerito e il vettore con un kit commerciale di purificazione PCR. </li></ol></li><li> ligation <ol><li> Impostare la reazione per la legatura in provette da PCR di cui 2 ml 10x T4 tampone DNA ligasi, 10 ng TK-Luc vettore, inserto 50 ng (prodotto di PCR digerito), 1 ml T4 DNA ligasi (400 U / ml) e priva di nucleasi acqua fino a 20 microlitri. NOTA: Preparare un controllo negativo in cui la reazione non contiene inserto. </li><li> Mescolare delicatamente la reazione pipettando su e giù, centrifugare brevemente le provette per PCR utilizzando mini-centrifuga e poi incubare a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Calore inattivare a 65 ° C per 10 minuti poi raffreddare in ghiaccio e usare 5 ml di prodotto per la trasformazione in 50 microlitri cellule competenti (ad esempio, DH5α). </li><li> Utilizzare procedura di shock termico standard per trasformare i batteri, raccogliere le colonie e isolare il DNA plasmide con un kit commerciale. Convalida tutti i costrutti da sequenziamento prima delle fasi successive. </li></ol></li><li> Trasfezione delle cellule ES <ol><li> Usare piatti 48 pozzetti. Aggiungere 200 ml 0,1% di gelatina solution / pozzetto 30 min prima placcatura cellule. </li><li> staminali embrionali (ES), le cellule piastra al giorno prima di trasfezione. Utilizzare ES cellule libera-feeder e la piastra ad una densità di 3 x 10 4 cellule per pozzetto in 250 microlitri ES media / bene. </li><li> Preparare le miscele plasmide (ciascuna miscela viene calcolato per 8 pozzi, 4 non trattata e 4 trattati con acido retinoico) Mix 1:. 1.250 ng TK-Luc vuoto (controllo negativo), 950 ng β-galattosidasi codifica vettore (βGal), Mix 2 : 1.250 ng TK-Luc HOXA1 enhancer (controllo positivo), 950 ng βGal, Mix 3: 1.250 ng TK-Luc PRMT8 enhancer (regione di interesse), 950 ng βGal. NOTA: cellule staminali embrionali esprimono i fattori di trascrizione desiderati (RAR / RXR). Lasciare pozzi untransfected per determinare i valori di base in seguito durante le misurazioni luciferasi e β-galattosidasi. </li><li> Aggiungere qualità trasfezione mezzi siero ridotto a ciascun plasmide mescolare fino a 106 microlitri volume totale (sufficiente per 8 pozzetti). </li><li> Aggiungere 4,5 microlitri transfect qualità ESione reagente quindi mescolare accuratamente pipettando 15 volte su e giù. Incubare la miscela di trasfezione per 10 minuti a RT. </li><li> Aggiungere 13 ml di mix trasfezione le cellule per bene, mescolare accuratamente pipettando. Posizionare le cellule di nuovo nel incubatore (37 ° C) O / N prima del trattamento ligando. </li><li> Rimuovere i supporti con cura mediante aspirazione dalle cellule e aggiungere 250 microlitri fresca media / pozzetto contenente 0,01 - 1 micron tutto-trans retinoico (RA) come concentrazione finale o DMSO come veicolo. Incubare le cellule per 24 - 48 ore. NOTA: L&#39;acido retinoico è sensibile alla luce. </li></ol></li><li> Preparazione di lisati cellulari <ol><li> Diluire 5x Lysis Buffer (1,25 ml 0,5 M Tris pH = 7.8, 1 ml 1 M ditiotreitolo (DTT) (in H 2 O), 10 ml di 0,1 M EDTA pH = 8,0, 50 ml di glicerolo, 5 ml di Triton X-100, sterili acqua fino a 100 ml) a 1x con acqua sterile, aggiungere 20 ml 1 M DTT / 10 ml e portare a RT prima dell&#39;uso. Preparare 10 ml per una piastra a 48 pozzetti il ​​giorno del test. </li&gt; <li> Rimuovere i supporti con cura per aspirazione da cellule. Lavare le cellule una volta con PBS 1x. Aggiungere 200 microlitri 1x tampone di lisi / pozzetto direttamente alle cellule. </li><li> Agitare per 2 ore a temperatura ambiente (lisi chimica). Congelare i lisati cellulari sulla piastra a -80 ° C (lisi meccanica). Lisati possono essere conservati a -80 ° C per diversi giorni. </li><li> Scongelare i lisati. Dopo aver completato lo scongelamento, trasferire lisati cellulari ad una piastra a 96 pozzetti utilizzando una pipetta multicanale elettronica. Trasferimento 80 ml di lisato cellulare a piastra a 96 pozzetti chiaro per il dosaggio β-galattosidasi e 40 ml di lisato cellulare a un piatto bianco per la misurazione della luciferasi. Evitare la formazione di eventuali bolle. </li></ol></li><li> β-galattosidasi Assay NOTA: beta-galattosidasi o seconde giornalisti alternativi debbano essere usati come controllo interno per tenere conto di non specifici variazioni sperimentali. <ol><li> Preparare tampone substrato β-galattosidasi: 80,0 g Na 2 HPO 4 • 7H 2 O,3,8 g NaH 2 PO 4 • H 2 O, 30,0 g KCl, 1,0 g MgSO 4 • 7H 2 O, portare a 1000 ml con acqua sterile. Regolare il pH a 7,4. Filtro sterilizzare (0,2 micron) e conservare a 4 ° C </li><li> Mescolare tampone substrato 1 ml β-galattosidasi con 4 mg ONPG (o-nitrofenil-β-D-galattosidasi). Aggiungere 3,5 ml di 2-mercaptoetanolo (βME) per 1 ml di tampone appena prima dell&#39;uso. Aggiungere 100 microlitri tampone del substrato β-galattosidasi al 80 microlitri lisato cellulare. </li><li> Incubare le reazioni a 37 ° C fino ad un colore giallo tenue è sviluppato. Leggere l&#39;assorbanza a OD 420 nm su un lettore di piastre ed esportare i dati. NOTA: Il tempo varia a seconda della efficienza di trasfezione, di solito non più di 30 min. </li></ol></li><li> Assay luciferasi <ol><li> Preparare 50 ml substrato luciferina reagente: 15.1 mg di sale D-luciferina, 82,7 mg di sale ATP, 185 mg MgSO 4 • 7H 2 O, aggiungere 50 ml di tubo di polipropilene,quindi aggiungere 1,5 ml 1 M tampone HEPES, 48,5 ml ATP acqua libera, vortice, assicurarsi che tutti i composti si dissolvono completamente. Tenere 5 - 10 ml aliquote a -80 ° C. </li><li> Warm 5 ml substrato luciferina reagente per RT prima di iniziare. Pipettare 100 microlitri reagente substrato a ciascun pozzetto della piastra bianca contenente 40 ml di lisato cellulare e misurare il segnale immediatamente utilizzando una macchina contatore luminescenti. </li><li> Ottenere le attività da almeno tre esperimenti indipendenti in trasfezioni triplice copia. </li><li> Calcolare prima il normalizzata l&#39;attività della luciferasi base e valori β-galattosidasi normalizzate di base per ogni bene sottraendo i valori medi misurati per le cellule non transfettate di ogni valore misurato. Quindi calcolare il rapporto di attività luciferasi / β-galattosidasi. </li></ol></li></ol> 3. Caratterizzazione di Enhancer RNA NOTA: Un indicatore più diretto di attività enhancer è emerso dalla recente genoma-wstudi ide che ha individuato molti RNA non codificanti brevi, di dimensioni variabili da 50 a 2.000 nt, che sono trascritti da esaltatori, e sono denominate RNA Enhancer (eRNA) 16,25,26 (Figura 4). eRNA induzione altamente correlata con l&#39;induzione di geni esone codificante adiacenti. Così, l&#39;attività enhancer segnale-dipendente può essere quantificato in vivo confrontando la produzione eRNA tra varie condizioni di RT-qPCR. <ol><li> Linee guida per la progettazione Primer per il rilevamento Erna di RT-qPCR <ol><li> Selezionare regioni genomiche per misure erna che sono almeno 1,5 - 2 kb lontano da siti di inizio della trascrizione annotati. NOTA: È importante sottolineare che, alti livelli di mRNA trascrizione attraverso esaltatori intragenica prevenire quantificazione accurata Erna nell&#39;orientamento senso, eRNA antisenso a esaltatori intragenica sono rilevabili e sono simili a livello di eRNA a esaltatori extrageniche. </li><li> Come regola generale, utilizzare le regioni 200 - 1.000 bp from il centro del fattore di trascrizione sito di interesse per la progettazione di primer sia sul senso o antisenso filamento (Figura 4 e Figura 6) vincolante. NOTA: Se GRO-ss, DNasi-ss, H3K4me1, H3K4me3 o dati H3K27ac ChIP-Seq sono disponibili presso i tipi di cellule desiderate e condizioni può essere utilizzato per la progettazione di primer più accurata. eRNA sono trascritti dalle regioni enhancer putativo caratterizzate da alti livelli di H3K4me1 e ME3. L&#39;espressione di eRNA correla positivamente con l&#39;arricchimento di attivazione marchio enhancer istone H3K27ac. </li><li> Progettazione PCR primer per la misurazione RT-qPCR di eRNA a base di colorante fluorescente di Primer3 (http://bioinfo.ut.ee/primer3/) 23 Generare la sequenza anti-senso (complemento del filamento senso inverso) per la progettazione di fondo come per: http://www.bioinformatics.org/sms/rev_comp.html. Inserire 200-300 bp di senso o anti-senso sequenza per la progettazione di primer. </li></ol></li><li> Misura Erna Trascrizione </sTrong&gt; <ol><li> Isolare RNA totale da cellule trattate con acido commerciale di fenolo / cloroformio a base di reagente di estrazione in base alle raccomandazioni del fabbricante. </li><li> Utilizzare DNasiI per il trattamento di RNA isolato prima di utilizzarli nella reazione di trascrizione inversa. Inattivare DNasi secondo le raccomandazioni del fabbricante, prima di invertire la trascrizione. </li><li> Misurare la concentrazione di RNA dopo il trattamento DNasi I e usare 1,000 ng per reazione RT. Utilizzare trascrittasi inversa di alta qualità. NOTA: Come gran numero di eRNA non può essere poliadenilato, trascrizione inversa richiede l&#39;uso di primer casuali. </li><li> Rileva trascrizione inversa Erna di RT-qPCR utilizzando la procedura standard. Misurare un mRNA non-trattamento-dipendente per la normalizzazione (ad esempio, 36B4, PPIA, GAPDH, ACTB). </li></ol></li></ol>

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<li>Hollenberg, S. M., Giguere, V., Segui, P., Evans, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colocalization+of+DNA-binding+and+transcriptional+activation+functions+in+the+human+glucocorticoid+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Colocalization of DNA-binding and transcriptional activation functions in the human glucocorticoid receptor.</a> Cell. 49, 39-46 (1987).</li>
<li>Untergasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer3--new+capabilities+and+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Primer3--new capabilities and interfaces.</a> Nucleic Acids Res. 40, e115(2012).</li>
<li>Rhead, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UCSC+Genome+Browser+database%3A+update+2010%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The UCSC Genome Browser database: update 2010.</a> Nucleic Acids Res. 38, D613-D619 (2010).</li>
<li>Kim, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+transcription+at+neuronal+activity-regulated+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers.</a> Nature. 465, 182-187 (2010).</li>
<li>Wang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+transcription+by+distinct+classes+of+enhancers+functionally+defined+by+eRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reprogramming transcription by distinct classes of enhancers functionally defined by eRNA.</a> Nature. 474, 390-394 (2011).</li>
<li>Simandi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRMT1+and+PRMT8+regulate+retinoic+acid-dependent+neuronal+differentiation+with+implications+to+neuropathology%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">PRMT1 and PRMT8 regulate retinoic acid-dependent neuronal differentiation with implications to neuropathology.</a> Stem Cells. 33, 726-741 (2014).</li>
<li>Zhou, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Sox2+distal+enhancer+cluster+regulates+embryonic+stem+cell+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential.</a> Genes Dev. 28, 2699-2711 (2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Negli ultimi anni, i progressi nella tecnologia di sequenziamento hanno permesso di prevedere su larga scala gli enhancer in molti tipi di cellule e tessuti 7-9. Il flusso di lavoro sopra descritto consente di eseguire la caratterizzazione primaria dei candidati enhancer scelti sulla base dei dati ChIP-seq. I passaggi dettagliati e le note aiuteranno chiunque a impostare una convalida di routine del potenziatore in laboratorio.
La fase più critica nel test reporter della luciferasi ...

Lo sviluppo di un organismo multicellulare richiede un'espressione regolata con precisione di migliaia di geni nei tessuti in via di sviluppo. La regolazione dell'espressione genica è realizzata in gran parte dagli enhancer. Gli enhancer sono brevi elementi di DNA non codificanti che possono essere legati con fattori di trascrizione (TF) e agiscono a distanza per attivare la trascrizione di un gene bersaglio1. Gli enhancer sono generalmente cis-agenti e più frequentemente si trovano appena a monte del sito di inizio della trascrizione (TSS), ma studi recenti hanno anche descritto esempi in cui gli enhancer sono stati trovati molto più a monte, sul 3' del gene o anche all'interno degli introni e degli esoni2. 
Ci sono centinaia di migliaia di potenziali potenziatori nei genomi dei vertebrati1. Metodi recenti basati sull'immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) forniscono dati ad alto rendimento dell'intero genoma che possono essere utilizzati per l'analisi degli enhancer3-9. Sebbene i dati ottenuti dagli esperimenti ChIP-seq aumentino notevolmente la probabilità di identificare potenziatori specifici per cellule e tessuti, è importante tenere presente che i siti di legame rilevati non identificano necessariamente il legame diretto del DNA e/o gli enhancer funzionali. Pertanto, è indispensabile un'ulteriore analisi funzionale degli enhancer di nuova identificazione. In questo lavoro, presentiamo un processo di base in tre fasi di identificazione e convalida di potenziatori attivi putativi. Ciò include: 1) selezione di siti di legame di fattori di trascrizione putativi mediante analisi bioinformatica dei dati ChIP-seq, 2) clonaggio e convalida di queste sequenze regolatorie in costrutti reporter e 3) misurazione dell'RNA enhancer (eRNA). 
L'esposizione delle cellule staminali embrionali (ES) all'acido retinoico (RA) è spesso utilizzata per promuovere la differenziazione neurale delle cellule pluripotenti 10. L'artrite reumatoide esercita i suoi effetti legandosi ai recettori dell'artrite reumatoide (RARα, β, γ) e ai recettori X dei retinoidi (RXRα, β, γ). RAR e RXR in una forma di eterodimero si legano a motivi di DNA chiamati elementi di risposta RA, che sono tipicamente organizzati come ripetizioni dirette della sequenza AGGTCA (chiamata semisito) e regolano la trascrizione. Esperimenti di trattamento con ligandi hanno permesso l'identificazione di diversi geni regolati dall'acido retinoico nelle cellule ES 11,12. Tuttavia, gli elementi potenziatori per molti di questi geni non sono stati ancora descritti. Per dimostrare come il flusso di lavoro qui descritto possa essere utilizzato per l'identificazione e la validazione degli enhancer, mostriamo passo dopo passo la selezione e la caratterizzazione di due enhancer dipendenti dall'acido retinoico nelle cellule staminali embrionali.

<table><tbody><tr><td>KOD DNA polimerasi</td><td>Merck Millipore</td><td>71085-3</td><td>per l'amplificazione PCR dell'enhancer da gDNA</td></tr><tr><td>DNeasy Blood & Kit fazzoletti&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td>per l'isolamento del DNA genomico</td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>per la purificazione del prodotto PCR</td></tr><tr><td>Kit di estrazione del gel.</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td>per l'estrazione del gel se ci sono più prodotti PCR</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>NEB</td><td>R3104L</td><td>enzima di restrizione</td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>R3136L</td><td>enzima</td></tr><tr><td>di restrizione FastAP</td><td>Thermo Scientific</td><td>EF0651</td><td>rilascio di gruppi 5'- e 3'-fosfato dal DNA</td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td>per legatura</td></tr><tr><td>QIAprep Kit di spin Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>per l'isolamento dei plasmidi</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td>ES media</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td>ES media</td></tr><tr><td>MEM Aminoacido non essenziale</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td>ES media</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>ES media</td></tr><tr><td>Beta Mercaptoetanolo</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td>ES media</td></tr><tr><td>FuGENE HD&nbsp;</td><td>Reagente di trasfezione</td> <td>Promega</td><td>E2311</td></tr><tr><td>Opti-MEM&reg; I Reduced Serum Medium</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td>per la trasfezione</td></tr><tr><td>Acido retinoico all-trans</td><td>Sigma</td><td>R2625</td><td>ligando, per l'attivazione di RAR/RXR</td></tr><tr><td>96 pozzetti su piastra trasparente</td><td>Greiner</td><td>655101</td><td>per il test della beta galattosidasi</td></tr><tr><td>96 pozzetti</td><td>Greiner</td><td>655075</td><td>per il saggio della luciferasi</td></tr><tr><td>D-luciferina, sale di potassio</td><td>Goldbio.com</td><td>115144-35-9</td><td>per il test della luciferasi</td></tr><tr><td>ATP sale</td><td>Sigma</td><td>A7699-1G</td><td>per il test della luciferasi</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>per il test della luciferasi</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375-25G</td><td>per il test della luciferasi</td></tr><tr><td>Na2HPO4 &#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>431478-50G</td><td>per il dosaggio della Beta galattosidasi</td></tr><tr><td>NaH2PO4 &#8226; H2O</td><td>Sigma</td><td>S9638-25G</td><td>per il dosaggio della Beta galattosidasi</td></tr><tr><td>MgSO4&#8226; 7H2O</td><td>Sigma</td><td>230391-25G</td><td>per il dosaggio della beta galattosidasi</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541-500G</td><td>per il dosaggio della beta galattosidasi</td></tr><tr><td>ONPG (o-nitrofenil-&beta;-D-galattosidasi)</td><td>Sigma</td><td>N1127-1G</td><td>per il dosaggio della beta galattosidasi</td></tr><tr><td>TRIzol&reg;</td><td>Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>Isolamento dell'RNA</td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa del cDNA ad alta capacità</td><td>Life Technologies</td><td>4368814</td><td>la trascrizione inversa dell'eRNA</td></tr><tr><td>Senza RNA Dnase Promega</td><td></td><td>M6101</td><td>Trattamento con Dnasi</td></tr><tr><td>SsoFast Eva Green</td><td>BioRad</td><td>750000105</td><td>RT-qPCR mastermix</td></tr><tr><td>CFX384 Touch&trade; Sistema di rilevamento PCR in tempo reale Macchina</td><td>BioRad</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre BioTek Synergy 4</td><td>Contatore luminescente</td> <td>BioTek</td><td></td></tr></tbody></table>

previsione e validazione del gene regolatore elementi attivato durante retinoico acid induced embrionali cellule staminali differenziazione

Prediction and Validation of Gene Regulatory Elements Activated During Retinoic Acid Induced Embryonic Stem Cell Differentiation

Lo sviluppo embrionale è un processo a più fasi che coinvolge l&#39;attivazione e la repressione di molti geni. Elementi Enhancer nel genoma sono noti per contribuire al tessuto e cellula-tipo regolazione specifica dell&#39;espressione genica durante la differenziazione cellulare. Pertanto, la loro identificazione e un&#39;ulteriore indagine è importante per comprendere come il destino della cellula è determinata. Integrazione dei dati di espressione genica (ad esempio, microarray o RNA-Seq) e risultati di immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) basata su studi genome-wide (ChIP-Seq) permette l&#39;identificazione su larga scala di queste regioni regolatorie. Tuttavia, validazione funzionale di esaltatori specifici di tipo a cella richiede ulteriori in vitro e in vivo procedure sperimentali. Qui si descrive come esaltatori attivi possono essere identificati e validati sperimentalmente. Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro passo-passo che comprende: 1) l&#39;identificazione di regioni regolatorie attraverso l&#39;analisi, 2) la clonazione e exper dati ChIP-Seqconvalida imental del potenziale normativo putativo delle sequenze genomiche identificate in un saggio giornalista, e 3) determinazione dell&#39;attività enhancer in vivo misurando il livello trascrizione di RNA enhancer. Il protocollo presentato è abbastanza dettagliata per aiutare chiunque a creare questo flusso di lavoro nel laboratorio. Soprattutto, il protocollo può essere facilmente adattato e utilizzato in qualsiasi sistema modello cellulare.

Abbiamo utilizzato un anticorpo specifico-pan RXR al fine di identificare quali geni RA-regolati a livello di genoma hanno recettore arricchimento nella loro immediate vicinanze. L&#39;analisi bioinformatica delle RXR dati del chip-ss ottenuti da cellule ES trattate con acido retinoico ha rivelato l&#39;arricchimento del mezzo sito recettore nucleare (AGGTCA) sotto il RXR siti occupati (figura 1). Utilizzando un algoritmo di bioinformatica abbiamo mappato di nuovo il ris...

In questo lavoro forniamo un flusso di lavoro sperimentale su come i potenziatori attivi possono essere identificati e convalidati sperimentalmente.

Previsione e Validazione del gene regolatore elementi attivato durante retinoico Acid Induced embrionali cellule staminali Differenziazione

Embryonic development is a multistep process involving activation and repression of many genes. Enhancer elements in the genome are known to contribute to ...

L'obiettivo generale di questo video è fornire un insieme integrato di metodi per identificare e validare sperimentalmente elementi regolatori genomici, detti enhancer. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla trascrizione e regolazione di eventi biologici, inclusa la selezione e l'utilizzo di enhancer, durante la differenziazione cellulare o in risposta a stimoli esterni. Il principale vantaggio del flusso di lavoro presentato è che il protocollo può essere facilmente adattato e utilizzato in qualsiasi sistema modello cellulare.Illustrerò i passaggi della procedura. Per iniziare, scegliere un enhancer candidato in base ad un'analisi preesistente di chip seq. Utilizzare un browser genomico per visualizzare i risultati dell'esperimento di chip seq desiderato e identificare i siti di legame in prossimità del gene di interesse.Scegliere "Definire una regione di interesse" per ottenere una sequenza di 200-400 paia di basi della regione genomica selezionata e utilizzare le sequenze per la progettazione successiva dei primer. Mediante tecniche standard di biologia molecolare, amplificare e clonare la regione genomica selezionata in un costrutto plasmidico r

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Previsione e Validazione del gene regolatore elementi attivato durante retinoico Acid Induced embrionali cellule staminali Differenziazione (Video) | JoVE Journal

Previsione e Validazione del gene regolatore elementi attivato durante retinoico Acid Induced embrionali cellule staminali Differenziazione

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