Quantificare le attività di Cis-Regolamentazione Elementi nella retina di topo Elettroporazione Espianto

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di elettropurare impianti retinici di topo con reporter trascrizionali fluorescenti e quantificare i loro livelli di espressione. Ciò si ottiene isolando prima il tessuto retinico neonatale del topo mediante dissezione. Il secondo passo della procedura consiste nell'elettro della retina con costrutti reporter di DNA fluorescenti.

La terza fase della procedura consiste nel coltivare le retine elettroporate come impianti per otto giorni. La fase finale della procedura consiste nel raccogliere l'explan retinico e quantificare i livelli di espressione dei reporter fluorescenti. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano i livelli di espressione relativi di diversi costrutti reporter promotori nella retina del topo in via di sviluppo attraverso l'elettroporazione x explan, seguita dall'analisi quantitativa dei dati.

Mi chiamo Joe Corbo e sono un membro della facoltà del Dipartimento di Patologia e Immunologia della Washington University School of Medicine di St.Louis. E oggi presenteremo un protocollo video che dimostra la tecnica dell'elettroporazione X explan nelle retine di topi neonati allo scopo di quantificare l'attività degli elementi regolatori specifici del CYS del fotorecettore e a dimostrare questo protocollo sarà una studentessa laureata del mio laboratorio, Cindy Montana. Per prima cosa sterilizzare la camera di elettroporazione e tutti gli strumenti con etanolo al 70% in preparazione per il prelievo oculare.

Disinfettare sia i guanti che il banco di lavoro con etanolo e mantenere le condizioni di sterilità durante tutta la procedura. Successivamente, in una cappa di coltura tissutale, pipettare sei millilitri di terreno di dissezione in una piastra di Petri sterile da 60 millimetri e tre millilitri di terreno in due piastre sterili da 35 millimetri. Di nuovo sul banco, disinfetta la testa e il collo di un cucciolo di topo appena nato con etanolo al 70%.

Dopo aver decapitato rapidamente la testa con le forbici, trasferire la testa in un piatto sterile da 100 millimetri, tagliare via il cuoio capelluto con piccole forbici per esporre gli occhi al microscopio da dissezione. Usando una pinza curva, estrai delicatamente l'occhio dall'orbita e poi posiziona l'occhio in un piatto da 35 millimetri contenente dissezione. Medio. Continuare a raccogliere gli occhi in modo che ci siano tre o quattro occhi per aliquota di DNA da elettroporare, mantenendo gli occhi e il mezzo di dissezione a temperatura ambiente fino al termine.

Disinfettare sia la lama di rasoio che l'involucro di una pipetta di trasferimento in plastica sterile con etanolo al 70%, quindi utilizzare la lama di rasoio per tagliare la punta della pipetta abbastanza in alto da poter pipettare un intero occhio. Utilizzando la pipetta allargata, trasferire un occhio dal piatto da 35 millimetri al piatto da 60 millimetri sotto un microscopio da dissezione ad alta potenza. Usa una pinza fine per rimuovere qualsiasi tessuto come i muscoli extraoculari e il grasso dalla superficie dell'occhio.

Quindi rimuovere il nervo ottico pizzicandolo alla base. Per isolare la retina, praticare un piccolo foro nella sclera al limbus, la sclera e l'epitelio pigmentato retinico appaiono lucidi rispetto al tessuto retinico, che è Matt Gray. Inserire un polo di entrambe le paia di pinze nel foro e aprire delicatamente la sclera e l'RPE.

Assicurati di lasciare l'obiettivo in posizione. Utilizzare la pipetta allargata per spostare la retina sezionata nel secondo piatto da 35 millimetri contenente il terreno. Raccogli tutte le retine e conservale in un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius.

Fino all'elettroporazione in una cappa di coltura tissutale per ogni DNA Eloqua da elettroporare, riempire una piastra sterile da 35 millimetri con terreno di dissezione e una seconda piastra con terreno di coltura. Utilizzando una pipetta P 200, lavare le camere nella capsula di elettroporazione con una XPB S3 sterile per volte. Riempi le camere con le aliquote di DNA da 60 microlitri e riempi le camere inutilizzate con 60 microlitri di un XPBS.

Collegare gli elettrodi alla piastra di elettroporazione e inserire le impostazioni appropriate sull'elettro. Utilizzare una pinza sottile per afferrare le retine per il cristallino e trasferirle nelle camere di elettroporazione. Posizionamento di un massimo di quattro retine in ogni camera.

Disporre le retine in modo che la lente si appoggi alla barra metallica attaccata all'elettrodo positivo. Pulisci le pinze tra ogni camera per evitare il trasferimento di DNA da una camera all'altra. Una volta che tutte le retine sono allineate, premere start sull'elettro.

Piccole bolle dovrebbero formarsi sulla barra di metallo attaccata all'elettrodo negativo. Scollegare gli elettrodi e spegnere l'elettro con una pinza. Allontanare delicatamente le retine dalle pareti della camera.

Trasferire le retine dalle camere nelle piastre da 35 millimetri contenenti il mezzo di dissezione. Utilizzando una pipetta di trasferimento sterile, trasferire le retine dal terreno di dissezione alle piastre da 35 millimetri contenenti terreno di coltura. Etichettare i pozzetti di una piastra di coltura sterile a sei pozzetti e riempire ogni pozzetto con tre millilitri di coltura. Medio.

Utilizzare una pinza sterile per far galleggiare i filtri watman nuclei rotondi sopra il mezzo in ogni pozzetto con il lato lucido dei filtri rivolto verso l'alto. Con l'aiuto di un cannocchiale da dissezione, trasferire una singola retina sul filtro con la pipetta di trasferimento sterile con la lente rivolta verso il basso. Se la retina atterra con il lato della lente rivolto verso l'alto, aspirarla nuovamente nella pipetta e riprovare.

Metti non più di quattro retine in ogni pozzetto e tienile in goccioline separate. Una volta che le retine sono state posizionate nei pozzetti, spostare la piastra di coltura su un incubatore di coltura tissutale a 37 gradi Celsius e crescere per il periodo di tempo desiderato. Di solito otto giorni visti Ecco il successo dell'elettroporazione si traduce nell'espressione del costrutto del DNA attraverso un quarto o un terzo della superficie retinica.

I livelli di fluorescenza vengono quantificati confrontando le regioni elettroporate uniformemente che esprimono il costrutto CRE con le regioni al di fuori della retina e quindi normalizzandole per controllare l'espressione della GFP. I fotorecettori dei bastoncelli, in particolare, vengono trasdotti in modo efficiente. Ecco i risultati di un'elettroporazione in cui due promotori specifici per bastoncelli guidano l'espressione di GFP e DS red nello strato nucleare esterno.

Sovrapponendo i due modelli di espressione con la colorazione DPI mostrata qui in blu, è evidente l'espressione specifica del fotorecettore. Non si osserva alcuna espressione né nello strato interchiaro né nello strato delle cellule ganglionari. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona idea di come sezionare l'elettro e la coltura degli espianti retinici di topo allo scopo di quantificare l'attività degli elementi regolatori delle cisti retiniche.

Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.