Name: Quantificare le attività di Cis-Regolamentazione Elementi nella retina di topo Elettroporazione Espianto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Impara a quantificare l'attività degli elementi cis-regolatori nella retina del topo mediante elettroporazione di espianti. Questo metodo consente di analizzare l'espressione genica nei fotorecettori in vivo.

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Gli autori desiderano ringraziare Karen Lawrence per il suo aiuto con sezione che descrive la costruzione della camera di elettroporazione.

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Espianto elettroporazione è un mezzo semplice di quantificare cis-regolamentare l&#39;attività del mouse nella retina di sviluppo. Rispetto al cis-normativo analisi tramite transgenesi mouse, elettroporazione è molto più economico, che richiede solo cuccioli di topo neonato, il DNA, strumenti di dissezione, ed elettroporazione / cultura materiale dei tessuti. E &#39;anche molto meno tempo di consumo: esperimento si richiede solo poche ore di tempo di preparazione, un periodo di coltura di circa otto giorni, e poche ore alla fine della sperimentazione per l&#39;imaging e analisi dei dati. Espianto elettroporazione è anche superiore alla coltura cellulare a base di cis-regolamentazione analisi dal reale tessuto retinico viene utilizzato. La retina si sviluppa abbastanza normalmente in espianto cultura si forma tre strati distinti cellulare (strato esterno nucleare, nucleare strato interno e strato di cellule gangliari), anche se fotorecettori non riescono a elaborare segmenti esterni. Un ulteriore vantaggio è che elettroporazione espianto è altamente riproducibile. I costrutti stesso elettroporate in retine diversi, anche in giorni diversi, in genere si traduce in livelli stessa espressione relativa. Inoltre, poiché i plasmidi elettroporate si pensa siano mantenuti episomally nel nucleo e non sono incorporati nei cromosomi, essi non sembrano essere soggette agli effetti stesso sito di integrazione che tormentano cis-normativo analisi effettuate nei topi transgenici. Elettroporazione espianto ha diverse limitazioni. In primo luogo, solo le cellule che sono ancora nel ciclo cellulare può essere efficacemente trasdotte con elettroporazione 15. A P0, aste e altri più tardi, nato tipi di cellule della retina (cellule bipolari, cellule amacrine, M ller glia) sono i principali popolazioni di cellule bersaglio con questo metodo. Elettroporazione di fotorecettori cono da P0 elettroporazione è stato segnalato 16, ma l&#39;efficacia sembra essere basso. Un secondo limite è che la cultura espianto di là di due risultati settimane malformazione progressiva della retina e non è pertanto raccomandato. Se quantificazione promotore è tenuto a timepoints tardi, tuttavia, un elettroporazione in vivo 9 possono essere eseguite, seguita da dissezione della retina al timepoint desiderato, piatto di montaggio della retina sezionato, e quantificazione come descritto nella sezione 9. Una terza limitazione è che questo saggio è solo moderatamente elevato throughput. A differenza dei saggi di cultura a base di cellule che possono testare centinaia di costruzioni in un singolo esperimento, la tecnica descritta in questo protocollo richiede un minimo di un retina del mouse tutto per costruire. Così, solo un paio di dozzine di costruzioni possono essere ragionevolmente elettroporate in un giorno. Un avvertimento aggiuntivi rispetto alla quantificazione dell&#39;attività di promotore con l&#39;attuale approccio è che c&#39;è un potenziale di &#39;sanguinare-through&#39; di fluorescenza DsRed nel canale GFP, in particolare quando i promotori dosaggio molto forte. La ragione di questo è che lo spettro di emissione di DsRed in parte si sovrappone a quella di GFP. Per aggirare questo problema, filtri di emissioni ottimizzati dovrebbe essere utilizzato che riducano al minimo la sovrapposizione spettrale tra DsRed e GFP. Quando tali insiemi ottimizzato filtro non sono disponibili, un&#39;altra possibile soluzione sarebbe quella di utilizzare un blu-spostato proteina fluorescente (per esempio, BFP o CFP) al posto di GFP.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nome del reagente </th><th> Azienda </th><th> Numero di catalogo </th><th> Commenti (opzionale) </th></tr><tr><td> Elettroporazione piatto, Microslide 453 </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td> 45-0105 </td><td> Vedere la sezione 1 del protocollo per le modifiche </td></tr><tr><td> 100% gomma siliconica acquario cemento </td><td> Perfecto Produzione </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Microprovette cremagliera in plastica </td><td> Fisher Scientific </td><td> 05-541 </td><td> Solo il manico cremagliera saranno utilizzati </td></tr><tr><td> Dremel strumento </td><td></td><td></td><td> Per tagliare il manico fuori del rack tubo di plastica </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11965 </td><td></td></tr><tr><td> F12 </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 11765 </td><td></td></tr><tr><td> L-Glu/pen/strep </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 10378-016 </td><td> Concentrazione 100X </td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> I-6634 </td><td> Per magazzino 1000X, risospendere in 5mg/ml in 5mM HCl e filtro-sterilizzare </td></tr><tr><td> FBS </td><td> Gibco / Invitrogen </td><td> 26140-079 </td><td></td></tr><tr><td> ECM 830 onda quadra elettroporatore </td><td> BTX Harvard Apparatus </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nuclepore filtri </td><td> Whatman </td><td> 110606 </td><td> 25mm, 0.2μm </td></tr><tr><td> Tessuto cultura incubatore </td><td></td><td></td><td> 37 ° C, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> Coprioggetto di vetro # 1.5 </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-544E </td><td> 0,16 millimetri di spessore </td></tr><tr><td> Composto microscopio a fluorescenza dotato di telecamera </td><td></td><td></td><td> Fotocamera deve essere monocromatica (ad esempio, ORCA-ER fotocamera da Hamamatsu) </td></tr><tr><td> EGFP / DsRed set di filtri per il microscopio composto </td><td> Chroma Technology Corp. </td><td> 86007 </td><td> Questo bleedthrough set di filtri riduce al minimo tra il chanenels rosso e verde </td></tr><tr><td> ImageJ Software </td><td> NIH </td><td></td><td> <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> </td></tr></tbody></table>

quantificare le attività di cis-regolamentazione elementi nella retina di topo elettroporazione espianto

Quantifying the Activity of cis-Regulatory Elements in the Mouse Retina by Explant Electroporation

Fattori di trascrizione genetica all&#39;interno di reti cellulari di controllo del modello spazio-temporali e livelli di espressione dei loro geni bersaglio legandosi a cis-normativo elementi (Cres), breve (~ 300-600 pb) tratti di DNA genomico che può mentire a monte, a valle, o entro gli introni dei geni che controllano. CRES (cioè, esaltatori / promotori) in genere costituiti da più siti raggruppati vincolante per entrambe le attivatori e repressori trascrizionali 1-3. Essi servono come integratori logica di input trascrizionale dare un rendimento unitario nella forma di attività promotore spatiotemporally preciso e quantitativo esatto. La maggior parte degli studi di mammiferi cis-regolazione fino ad oggi hanno fatto affidamento sulla transgenesi mouse come un mezzo per saggiare la funzione potenziatore del CRES 4-5. Questa tecnica richiede tempo, costosa e, a causa degli effetti di sito di inserimento, in gran parte non quantitativi. D&#39;altra parte, analisi quantitative per mammiferi funzione CRE sono stati sviluppati in sistemi di coltura tissutale (ad esempio, test dual luciferasi), ma la rilevanza in vivo di questi risultati è spesso incerto. Elettroporazione offre un&#39;ottima alternativa per transgenesi mouse tradizionale in quanto consente sia la valutazione spazio-temporale e quantitativa di cis-regolamentazione dell&#39;attività in tessuti viventi dei mammiferi. Questa tecnica è stata particolarmente utile nell&#39;analisi di cis-regolazione del sistema nervoso centrale, specialmente nella corteccia cerebrale e della retina 6-8. Mentre elettroporazione del mouse della retina, sia in vivo ed ex vivo, è stato sviluppato e ampiamente descritto da Matsuda e Cepko 6-7,9, abbiamo recentemente sviluppato un approccio semplice per quantificare l&#39;attività di fotorecettori specifici CRES in elettroporate topo retine 10. Dato che la quantità di DNA che viene introdotto nella retina mediante elettroporazione può variare da esperimento per esperimento, è necessario includere una co-elettroporate &#39;di controllo di carico&#39; in tutti gli esperimenti. A questo proposito, la tecnica è molto simile al dosaggio doppio luciferasi utilizzato per quantificare l&#39;attività promotore in cellule in coltura. Quando il saggio fotorecettore cis-regolamentazione dell&#39;attività, elettroporazione è di solito eseguita in topi neonati (giorno dopo la nascita 0, P0) che è il tempo del picco di produzione asta 11-12. Una volta che i tipi di cellule della retina diventano post-mitotico, elettroporazione è molto meno efficiente. Dato l&#39;alto tasso di natalità asta nei topi appena nati e il fatto che aste costituiscono oltre il 70% delle cellule della retina topo adulto, la maggior parte delle cellule che sono elettroporate a P0 sono aste. Per questo motivo, bastoncelli sono le più facili tipo di cellule della retina per studiare tramite elettroporazione. La tecnica che descriviamo qui è soprattutto utile per quantificare l&#39;attività del CRES fotorecettori.

Questo protocollo descrive un modo semplice ed economico per quantificare l&#39;attività del cis-elementi normativi (ad esempio, enhancer / promoter), nel vivere retine del mouse tramite elettroporazione espianto. Preparazione di analisi del DNA, la dissezione della retina, elettroporazione, cultura espianto della retina, e post-fissazione e la quantificazione sono descritti.

Quantificare le attività di Cis-Regolamentazione Elementi nella retina di topo Elettroporazione Espianto

I fattori di trascrizione all'interno delle reti geniche cellulari controllano il pattern spatiotemporale e i livelli di espressione dei loro geni target legandosi a...

L'obiettivo generale di questa procedura è elettroporare impianti retinici di topo con reporter fluorescenti trascrizionali e quantificare i loro livelli di espressione. Questo viene ottenuto isolando innanzitutto il tessuto retinico di topo neonatale mediante dissezione. Il secondo passaggio della procedura consiste nell'elettroporare la retina con costrutti di DNA reporter fluorescenti.Il terzo passaggio della procedura consiste nel coltivare le retine elettroporate come innesti per otto giorni. L'ultimo passaggio della procedura prevede il recupero dell'espianto retinico e la quantificazione dei livelli di espressione dei reporter fluorescenti. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano i livelli relativi di espressione di diversi costrutti reporter con promotori nella retina in via di sviluppo del topo mediante elettroporazione di x espianti retinici, seguita da un'analisi quantitativa dei dati.Il mio nome &egrave; Joe Corbo e sono un membro del corpo docente del Dipartimento di Patologia e Immunologia presso la Washington University School of Medicine di St. Louis. Oggi presenteremo un protocollo video che illustra la tecnica di elettroporazione X explan nelle retine di topi neonati, al fine di quantificare l'attivit&agrave; di elementi regolatori cis specifici dei fotoricettori, e a dimostrare questo protocollo sar&agrave; una studentessa laureata del mio laboratorio, Cindy Montana. Prima sterilizzare la camera di elettroporazione e tutti gli strumenti con etanolo al 70% in preparazione del prelievo oculare.Disinfettare entrambi i guanti e il piano di lavoro con etanolo e mantenere condizioni sterili per tutta la durata della procedura. Successivamente, in una cappa a flusso laminare, pipettare sei millilitri di mezzo di dissezione in una piastra di Petri sterile da 60 millimetri e tre millilitri di mezzo in due piastre sterili da 35 millimetri. Nuovamente al banco di lavoro, disinfettare la testa e il collo di un topo neonato con etanolo al 70%.Dopo aver decapitato rapidamente la testa utilizzando forbici, trasferire la testa in una piastra sterile da 100 millimetri, rimuovere il cuoio capelluto con piccole forbici per esporre gli occhi sotto un microscopio stereoscopico. Utilizzando pinze curve, estrarre delicatamente l'occhio dall'orbita e quindi posizionarlo in una piastra da 35 millimetri contenente il mezzo di dissezione. Continuare a raccogliere occhi in modo da ottenere da tre a quattro occhi per ogni aliquota di DNA da elettroporare, mantenendo occhi e mezzo di dissezione a temperatura ambiente fino al completamento.Disinfettare sia una lametta da rasoio che l'involucro di una pipetta di trasferimento in plastica sterile con etanolo al 70%, quindi utilizzare la lametta per tagliare la punta della pipetta abbastanza in alto da poter pipettare un intero occhio. Utilizzando la pipetta allargata, trasferire un occhio dalla piastra da 35 millimetri alla piastra da 60 millimetri sotto un microscopio stereoscopico ad alta potenza. Usare pinzette fini per rimuovere eventuali tessuti, come i muscoli estrinseci e il tessuto adiposo, dalla superficie dell'occhio.Quindi rimuovere il nervo ottico staccandolo alla base. Per isolare la retina, praticare un piccolo foro nella sclera al livello del limbus; la sclera e l'epitelio pigmentato retinico appaiono lucidi rispetto al tessuto retinico, che è grigio opaco. Inserire una punta di ciascuna coppia di pinze nel foro e strappare delicatamente la sclera e l'epitelio pigmentato retinico (RPE).Assicurarsi di lasciare la lente al suo posto. Utilizzare la pipetta allargata per trasferire la retina dissezionata nella seconda piastra da 35 millimetri contenente mezzo di coltura. Raccogliere tutte le retine e conservarle in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius.Finché non si esegue l'elettroporazione all'interno di una cappa per colture cellulari per ogni DNA Eloqua da elettroporare, riempire una piastra sterile da 35 millimetri con mezzo di dissezione e una seconda piastra con mezzo di coltura. Utilizzando una pipetta P200, lavare le camere della piastra per elettroporazione con 1x PBS sterile per 3 volte. Riempire le camere con aliquote di DNA da 60 microlitri e riempire tutte le camere non utilizzate con 60 microlitri di 1x PBS.Collegare gli elettrodi alla capsula di elettroporazione e impostare le condizioni appropriate sull'elettroporatore. Utilizzare pinzette fini per afferrare le retine attraverso il cristallino e trasferirle nelle camere di elettroporazione. Posizionare fino a quattro retine in ogni camera.Disporre le retine in modo che la lente appoggi sulla barra metallica collegata all'elettrodo positivo. Pulire le pinzette tra una camera e l'altra per evitare il trasferimento di DNA da una camera all'altra. Una volta allineate tutte le retine, premere il pulsante di avvio sull'elettroporatore.Dovrebbero formarsi piccole bolle sulla barra metallica collegata all'elettrodo negativo. Scollegare gli elettrodi e spegnere l'elettro utilizzando pinzette. Spostare delicatamente le retine lontano dalle pareti della camera.Trasferire le retine dalle camere alle piastre da 35 millimetri contenenti il mezzo di dissezione. Utilizzando una pipetta sterile, trasferire le retine dal mezzo di dissezione alle piastre da 35 millimetri contenenti il mezzo di coltura. Etichettare le pozzette di una piastra di coltura sterile a sei pozzette e riempire ciascuna pozzetta con tre millilitri di mezzo di coltura.Utilizzare pinze sterili per posizionare delicatamente filtri circolari Watman Nucleo sulla superficie del mezzo in ogni pozzetto, con il lato lucido dei filtri rivolto verso l'alto. Con l'aiuto di un microscopio stereoscopico, trasferire una singola retina sul filtro utilizzando una pipetta sterile, con il lato della lente rivolto verso il basso. Se la retina si posiziona con il lato della lente rivolto verso l'alto, aspirarla nuovamente nella pipetta e riprovare.Posizionare non più di quattro retine in ciascun pozzetto, mantenendole in gocce separate. Una volta posizionate le retine nei pozzetti, trasferire la piastra di coltura in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e coltivare per il tempo desiderato. Di solito, dopo otto giorni, qui si osservano risultati soddisfacenti di elettroporazione, con espressione del costrutto di DNA su un quarto fino a un terzo della superficie retinica.I livelli di fluorescenza vengono quantificati confrontando regioni uniformemente elettroporate che esprimono il costrutto CRE con regioni al di fuori della retina, quindi normalizzati rispetto all'espressione di controllo di GFP. I fotorecettori a bastoncello in particolare vengono trasdotti in modo efficiente, come mostrato. Di seguito sono riportati i risultati di un'elettroporazione in cui due promotori specifici per i bastoncelli guidano l'espressione di GFP e DS red nello strato nucleare esterno.Sovrapponendo i due profili di espressione alla colorazione con DPI mostrata qui in blu, risulta evidente l'espressione specifica dei fotorecettori. Non si osserva alcuna espressione né nel livello interclear né nel livello delle cellule gangliari. Dopo aver visto questo video, dovreste avere un'idea chiara di come si esegue la dissezione, l'elettrofisiologia e la coltura di espianti retinici murini al fine di quantificare l'attività degli elementi regolatori dei cisti retinici.Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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