Senza lenti microscopia a fluorescenza su un chip

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare una piattaforma di microscopia fluorescente senza lente su chip per l'immagine di oggetti fluorescenti su un campo visivo estremamente ampio. Per raggiungere questo scopo, un sottile filtro assorbente e una piastra ottica in fibra vengono posizionati delicatamente sopra un array di sensori optoelettronici, o un sensore CCDC moss, quindi un chip microfluidico viene disposto sopra la piastra. Successivamente, un prisma viene assemblato con il microchip mediante l'utilizzo di olio con indice di rifrazione abbinato.

La citazione fluorescente viene ottenuta attraverso la faccia laterale di un prisma romboide e l'illuminazione olografica avviene attraverso la faccia superiore dello stesso prisma. In definitiva, è possibile ottenere immagini microscopiche ad alta risoluzione dalle immagini fluorescenti acquisite decodificando le immagini grezze mediante algoritmi digitali. Se necessario, gli oggetti fluorescenti decodificati possono essere automaticamente conteggiati utilizzando un'interfaccia appositamente sviluppata.

Lente su chip. L'imaging in generale mira a sostituire i microscopi ottici basati su lenti ingombranti con progettazioni più semplici e compatte. Questa piattaforma tecnologica emergente ha il potenziale di eliminare la necessità di componenti ingombranti e costosi grazie all'ausilio di nuove teorie e algoritmi digitali di ricostruzione.

L'elenco delle lenti sulla piattaforma di imaging su chip comprende diversi componenti ottici, tra cui un array di sensori digitali, una sorgente di illuminazione incoerente, un prisma, un filtro di assorbimento e una piastra in fibra ottica oppure un raccordo in fibra ottica. In questa piattaforma, diversi tipi di array di sensori possono essere utilizzati per la rilevazione del segnale fluorescente proveniente da micro oggetti bersaglio. Ai fini di questo video, verrà utilizzato un dispositivo a accoppiamento di carica, mentre per l'eccitazione della fluorescenza si userà una sorgente luminosa incoerente, come un semplice diodo a emissione luminosa.

Vengono utilizzati in parallelo due diversi metodi di filtraggio dell'eccitazione per creare lo sfondo in campo scuro richiesto, come mostrato in questo diagramma. In primo luogo, un prisma di vetro o un emisfero di vetro viene utilizzato per creare una riflessione totale interna o TIR sulla superficie inferiore del chip microfluidico che ospita i campioni di interesse. Parallelamente a questo, un filtro assorbente economico viene utilizzato per rimuovere le luci di eccitazione debolmente diffuse che non seguono il processo di TIR.

Dopo il corretto rigetto dell'eccitazione mediante questi due meccanismi, viene acquisita al piano del rivelatore soltanto l'emissione fluorescente dei campioni. Nonostante un'apertura numerica di rilevamento così elevata, le macchie fluorescenti grezze sull'array del sensore diventano abbastanza ampie, per facilitarne l'ingegnerizzazione e un migliore controllo della diffusione spaziale di questo segnale fluorescente. Una piastra in fibra ottica verrà posizionata tra il piano dell'oggetto e quello del sensore come alternativa a una piastra standard.

Una piastra ottica a fibra conica, che presenta una densità significativamente maggiore di cavi in fibra ottica sulla sua faccia superiore rispetto a quella inferiore, può essere utilizzata per ottenere immagini ad alta risoluzione mediante ingrandimento. I chip microfluidici impiegati in questa piattaforma vengono realizzati utilizzando pareti in poli dimetil silossano posizionate su vetrini per creare i microcanali necessari all’imaging su chip, iniziando l’assemblaggio della piattaforma per imaging su chip senza supporto. Per prima cosa, rimuovere il vetrino di copertura dell’array sensori optoelettronico utilizzando una penna a vuoto, quindi posizionare delicatamente un sottile filtro assorbente sulla parte superiore della superficie attiva del rivelatore.

Posizionare una piastra ottica in fibra sopra questo filtro di assorbimento. Successivamente, posizionare direttamente sopra la piastra ottica in fibra il chip microfluidico realizzato. Poi, un prisma di vetro viene assemblato al di sopra del chip microfluidico utilizzando olio con indice di rifrazione abbinato, in modo che l'indice di rifrazione dell'interfaccia corrisponda all'indice di rifrazione del vetro.

Collegare le sorgenti luminose ai cavi in fibra ottica utilizzando connettori FC. Uno degli aspetti più difficili di questa procedura è l'allineamento dei componenti. Allineare con attenzione le distanze tra i componenti, la posizione e l'angolo dell'illuminazione.

Infine, avvicinare la fibra di illuminazione laterale al prisma e regolarne l'angolo per assicurare che si verifichi la riflessione totale interna all'interfaccia vetro-aria corrispondente alle cartucce microfluidiche. Il substrato inferiore, diverse cellule o modelli animali di piccole dimensioni possono essere analizzati mediante questa piattaforma integrata, ma ai fini della presente dimostrazione verranno analizzati i globuli bianchi. Per etichettare i globuli bianchi con un colorante fluorescente, mescolare innanzitutto circa 100 microlitri di sangue intero con circa un millilitro di tampone per la lisi dei globuli rossi, incubare per circa tre minuti a temperatura ambiente, quindi centrifugare la soluzione ematica.

Dopo aver rimosso il livello superiore utilizzando una micropipetta, risospendere il livello del pellet in soluzione salina tamponata al fosfato per etichettare gli acidi nucleici delle cellule con un colorante fluorescente; aggiungere SYTO 16 alla sospensione risospesa, quindi incubare il campione per circa 30 minuti al buio a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, centrifugare il campione etichettato. Rimuovere il sopranatante per ridurre il rumore di fondo dovuto all'emissione fluorescente dei coloranti non legati.

Reese ha sospeso il pellet di globuli bianchi in circa cinque millilitri di PBS. Il campione è ora pronto per essere caricato nel chip microfluidico per l'analisi fluorescente senza lente direttamente sul chip. Prima dell'analisi dei globuli bianchi, la piattaforma di imaging deve essere calibrata utilizzando microsfere fluorescenti.

Preparare un campione diluito di microsfere utilizzando acqua deionizzata e soluzione concentrata di perline. Utilizzando una siringa con ago sottile, iniettare questo campione iniziale nel chip microfluidico dal lato delle pareti in PDMS.

Dopo aver assemblato i componenti per ottenere l'immagine fluorescente su chip, acquisire immagini grezze di microsfere fluorescenti utilizzando l'interfaccia personalizzata sviluppata in LabVIEW tramite un computer. Assicurarsi di verificare che siano presenti almeno 20 immagini di microsfere fluorescenti isolate in tutto il campo visivo. Salvare i dati di calibrazione, che verranno utilizzati successivamente per calibrare ed estrarre la funzione di diffusione del punto della piattaforma di microscopia fluorescente senza lente.

Rimuovere il chip microfluidico contenente il campione di perle fluorescenti e staccare il prisma da questo chip. Iniettare il campione di globuli bianchi precedentemente preparato in un altro chip microfluidico non utilizzato, dal lato delle pareti in PDMS. Assemblare nuovamente i componenti con le stesse condizioni sperimentali, in particolare per quanto riguarda le distanze e la potenza di eccitazione.

Acquisire le immagini grezze dei globuli bianchi utilizzando la vista personalizzata del laboratorio con gli stessi parametri software impiegati per le microsfere fluorescenti. I dati di calibrazione e le immagini grezze dei globuli bianchi vengono quindi utilizzati per creare immagini ad alta risoluzione in MATLAB mediante elaborazione digitale. Qui vengono mostrati risultati rappresentativi di immagini fluorescenti in campo largo con lente su chip di una miscela contenente particelle verdi fluorescenti di quattro micron e 10 micron a scopo comparativo, microscopio 10x.

Vengono fornite anche immagini oggettive, che mostrano un buon accordo con le immagini fluorescenti senza lente mostrate. Di seguito, i risultati di un'immagine fluorescente a campo largo senza lente di una miscela contenente particelle fluorescenti verdi da 10 micron e particelle fluorescenti rosse da 10 micron. Le immagini fluorescenti senza lente mostrano una corrispondenza adeguata con le immagini ottenute con obiettivo microscopico 10x degli stessi campioni.

Questa figura mostra un confronto delle prestazioni tra la deconvoluzione di Lucy Richardson e il campionamento compressivo basato su algoritmi di decodifica, per l'imaging di diverse coppie di microsfere da 10 micron. La riga superiore illustra le immagini fluorescenti grezze senza lente, in cui le immagini inserite mostrano i confronti al microscopio delle stesse particelle ottenuti utilizzando un obiettivo da 10x. La riga centrale mostra i risultati della decodifica compressiva, mentre la riga inferiore illustra i risultati della deconvoluzione di Lucy Richardson. DDCS e DLR si riferiscono rispettivamente alle distanze tra i centri, alle immagini al microscopio, alle immagini senza lente decodificate tramite campionamento compressivo (CS) e alle immagini senza lente deconvolute tramite metodo di Lucy Richardson (LR).

Successivamente, viene illustrata l'elaborazione digitale delle immagini grezze con minore fluorescenza della lente. Per ottenere una risoluzione spaziale inferiore a quattro micron, risolvendo coppie di microsfere di due micron di diametro strettamente impacchettate, si utilizza un algoritmo basato su campionamento compressivo. Gli insetti mostrano confronti ottenuti con obiettivo microscopico 40x, che concordano molto bene con le immagini fluorescenti decodificate.

Qui, D si riferisce alle distanze tra centro e centro nelle immagini al microscopio. Mentre DCS indica le distanze tra centro e centro nella lente CS decodificata, in immagini meno fluorescenti. Questa figura mostra i risultati dell'imaging senza lente di cellule bianche del sangue marcate fluorescentemente.

Le immagini grezze senza lente vengono decodificate rapidamente mediante un decodificatore basato sulla compressive sensing (CS), che mostra un'elevata concordanza con un'immagine ottenuta tramite microscopio convenzionale dello stesso campione, acquisita con un obiettivo da 10x. Oltre all'imaging, se necessario, gli oggetti fluorescenti decodificati possono essere contati automaticamente utilizzando un'interfaccia sviluppata su misura per applicazioni di citometria su chip. Qui viene illustrata un'interfaccia personalizzata per il conteggio automatico di oggetti fluorescenti realizzata in Matlab. Abbiamo appena dimostrato la procedura per la microscopia fluorescente senza lenti di cellule marcate e microoggetti su un campo visivo di otto centimetri quadrati.

Una piattaforma di imaging per navi confrontata con il decoder compressivo rapido sottostante. Sarà piuttosto variabile per applicazioni di citometria ad alto rendimento, analisi di micro campioni rari e ricerche su cellule reali.