Senza lenti microscopia a fluorescenza su un chip

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare una piattaforma di microscopia fluorescente su chip senza lenti per l'imaging di oggetti fluorescenti su un campo visivo ultra ampio. Per raggiungere questo obiettivo, un sottile filtro di assorbimento e una piastra frontale in fibra ottica vengono posizionati delicatamente sopra un array di sensori optoelettrici, o muschio CCDC, e quindi un chip microfluidico viene posizionato sopra la piastra frontale. Successivamente, un prisma viene assemblato con il microchip attraverso l'uso di olio di corrispondenza dell'indice.

La citazione fluorescente si ottiene attraverso la sfaccettatura laterale di un prisma romboidale e l'illuminazione olografica viene eseguita attraverso la sfaccettatura superiore dello stesso prisma. In definitiva, dalle immagini fluorescenti acquisite è possibile ottenere immagini microscopiche ad alta risoluzione decodificando le immagini grezze attraverso algoritmi digitali. Se necessario, gli oggetti fluorescenti decodificati possono essere contati automaticamente utilizzando un'interfaccia sviluppata su misura.

Obiettivo su chip. L'imaging in generale mira a sostituire gli ingombranti microscopi ottici basati su lenti con design più semplici e compatti. Questa piattaforma tecnologica emergente ha il potenziale per eliminare la necessità di componenti ingombranti e costosi attraverso l'aiuto di nuove teorie e algoritmi di ricostruzione digitale.

L'elenco delle lenti sulla piattaforma di imaging su chip comprende diversi componenti ottici, tra cui un array di sensori digitali, una sorgente di illuminazione incoerente, un prisma, un filtro di assorbimento e una piastra frontale in fibra ottica o un cono in fibra ottica. In questa piattaforma, è possibile utilizzare diversi tipi di array di sensori per il rilevamento del segnale fluorescente da micro oggetti target. Ai fini di questo video, verrà utilizzato un dispositivo ad accoppiamento di carica, una sorgente di luce incoerente, come un semplice diodo a emissione di luce, per l'eccitazione della fluorescenza.

Due diversi metodi di filtraggio dell'eccitazione vengono utilizzati in parallelo per creare lo sfondo del campo scuro richiesto, come mostrato in questo diagramma. In primo luogo, viene utilizzato un prisma di vetro o un emisfero di vetro per creare una riflessione interna totale o TIR sulla superficie inferiore del chip microfluidico che ospita i campioni di interesse. Parallelamente, viene utilizzato un filtro di assorbimento economico per rimuovere le luci di eccitazione diffuse settimanalmente che non obbediscono al processo TIR.

Dopo il rifiuto riuscito dell'eccitazione utilizzando questi due meccanismi, viene acquisita solo l'emissione fluorescente dei campioni sul piano del rivelatore. Nonostante un'apertura numerica di rilevamento così ampia, le macchie fluorescenti grezze sull'array di sensori diventano abbastanza ampie per progettare e controllare meglio la diffusione spaziale di questo segnale fluorescente. Una piastra frontale in fibra ottica sarà posizionata tra l'oggetto e i piani del sensore in alternativa a una normale piastra frontale.

Una piastra frontale in fibra ottica conica, che ha una densità significativamente maggiore di cavi in fibra ottica sulla sua sfaccettatura superiore rispetto a quella inferiore, può essere utilizzata per immagini a risoluzione più elevata attraverso l'ingrandimento. I chip microfluidici utilizzati in questa piattaforma sono fabbricati utilizzando pareti in polidimetilsloane posizionate su vetrini per creare i micro canali necessari per l'imaging su chip per iniziare l'assemblaggio della piattaforma di imaging su chip senza terra. Innanzitutto, rimuovere il vetro di copertura dell'array di sensori optoelettronici utilizzando una penna a vuoto, posizionare delicatamente un filtro di assorbimento sottile sulla parte superiore dell'area attiva del rivelatore.

Posizionare una piastra frontale in fibra ottica sopra questo filtro ad assorbimento. Quindi posizionare il chip microfluidico fabbricato direttamente sopra l'array di fibre ottiche. Successivamente, un prisma di vetro viene assemblato sopra il chip microfluidico utilizzando l'olio corrispondente all'indice in modo tale che l'indice di rifrazione dell'interfaccia corrisponda all'indice di rifrazione del vetro.

Collegare le sorgenti luminose ai cavi in fibra ottica tramite l'utilizzo di connettori FC. Uno degli aspetti più difficili di questa procedura è l'allineamento dei componenti. Allineare accuratamente le distanze tra i componenti, la posizione e l'angolo di illuminazione.

Infine, avvicinare la fibra di illuminazione laterale al prisma e regolarne l'angolazione per garantire che la riflessione interna totale avvenga all'interfaccia dell'aria in vetro corrispondente ai chip microfluidici. Il substrato inferiore, varie cellule o piccoli modelli animali possono essere visualizzati utilizzando questa piattaforma su chip, ma ai fini di questa dimostrazione verranno visualizzati i globuli bianchi. Per etichettare i globuli bianchi con un colorante fluorescente, mescolare prima circa 100 microlitri di sangue intero con circa un millilitro di tampone di risalita dei globuli rossi, incubare per circa tre minuti a temperatura ambiente, quindi centrifugare la soluzione di sangue bugiardo.

Dopo aver rimosso lo strato superiore utilizzando una micropipetta, risospendere lo strato di pellet in soluzione salina tamponata con fosfato per marcare l'acido nucleico delle cellule con colorante fluorescente, aggiungere SYTO 16 alla sospensione di resus e quindi incubare il campione per circa 30 minuti al buio a temperatura ambiente. Dopo 30 minuti, centrifugare il campione etichettato. Rimuovere il supinato per ridurre il rumore di fondo dovuto all'emissione fluorescente di coloranti non legati.

Reese ha piegato lo strato di pellet dei globuli bianchi in circa cinque millilitri di PBS. Il campione è ora pronto per essere caricato nel chip microfluidico per l'imaging fluorescente senza lenti su chip. Prima di eseguire l'imaging dei globuli bianchi, la piattaforma di imaging deve essere calibrata utilizzando microsfere fluorescenti.

Preparare il campione di microsfere diluito utilizzando acqua deionizzata e una soluzione di microsfere grezze. Utilizzando una siringa ad ago affilato. Iniettare questo campione iniziale nel chip microfluidico dal lato delle pareti del PDMS.

Dopo aver assemblato i componenti per ottenere l'imaging fluorescente su chip, acquisire immagini grezze di microsfere fluorescenti utilizzando l'interfaccia di visualizzazione del laboratorio sviluppata su misura attraverso un computer. Assicurati di controllare che ci siano almeno 20 immagini di perline fluorescenti isolate su tutto il campo visivo. Salvare i dati di calibrazione, che verranno utilizzati in seguito per calibrare ed estrarre la funzione di diffusione del punto della piattaforma di microscopia fluorescente senza lenti.

Rimuovere il chip microfluidico contenente il campione di perlina fluorescente e staccare il prisma da questo chip. Iniettare il campione di globuli bianchi precedentemente preparato in un altro chip microfluidico inutilizzato dal lato delle pareti del PDMS. A riassemblare i componenti con le stesse condizioni sperimentali, soprattutto per quanto riguarda le distanze e la potenza di eccitazione.

Acquisisci le immagini grezze dei globuli bianchi utilizzando la vista di laboratorio personalizzata con gli stessi parametri software utilizzati per le microsfere fluorescenti. I dati di calibrazione e le immagini grezze dei globuli bianchi vengono quindi utilizzati per creare immagini a risoluzione più elevata in MATLAB attraverso l'elaborazione digitale. I risultati rappresentativi dell'imaging fluorescente su chip con lente ad ampio campo di una miscela contenente particelle fluorescenti verdi da quattro micron e 10 micron sono mostrati qui a scopo di confronto, microscopio 10 x.

Vengono fornite anche immagini oggettive, che si accordano bene con le immagini meno fluorescenti mostrate con l'obiettivo. Successivamente, un risultato di lenti a campo largo, imaging meno fluorescente di una miscela contenente particelle fluorescenti verdi da 10 micron e rosse da 10 micron. Le immagini fluorescenti senza lenti forniscono una corrispondenza decente con le immagini dell'obiettivo del microscopio 10 x degli stessi campioni.

Questa figura fornisce un confronto delle prestazioni della deconvoluzione di Lucy Richardson e del campionamento compressivo basato su algoritmi di decodifica per l'imaging di varie coppie di perline da 10 micron. La riga superiore illustra le immagini fluorescenti meno grezze dell'obiettivo, in cui le immagini inserite mostrano i confronti al microscopio delle stesse particelle che sono necessari utilizzando un obiettivo 10x. La riga centrale mostra i risultati della decodifica compressiva, mentre la riga inferiore illustra i risultati della deconvoluzione di Lucy Richardson DDCS e DLR si riferiscono rispettivamente alle distanze da centro a centro e alle immagini del microscopio, alle immagini delle lenti decodificate CS e alle immagini LR de convoluted lens less.

Successivamente, viene illustrata l'elaborazione digitale dell'obiettivo, immagini grezze meno fluorescenti. Un algoritmo basato sul campionamento compressivo viene utilizzato per ottenere una risoluzione spaziale inferiore a quattro micron risolvendo coppie di perline di due micron di diametro. I riquadri mostrano 40 confronti di obiettivi per microscopio, che concordano molto bene con le immagini fluorescenti decodificate.

Qui D si riferisce alle distanze da centro a centro nelle immagini al microscopio. Mentre la DCS si riferisce alle distanze da centro a centro nella lente decodificata CS, immagini meno fluorescenti. Questa figura mostra i risultati dell'imaging senza lente di globuli bianchi marcati in fluorescenza.

Le immagini grezze prive di lenti vengono decodificate rapidamente utilizzando un decodificatore basato su CS, che si accorda molto bene con un'immagine al microscopio convenzionale dello stesso campione acquisita con una lente obiettivo 10x. Oltre all'imaging, se necessario, gli oggetti fluorescenti decodificati possono anche essere contati automaticamente utilizzando un'interfaccia sviluppata su misura per applicazioni di citometria su chip. Abbiamo appena dimostrato la procedura per la microscopia fluorescente senza terra di cellule marcate e micro battiti su un campo visivo di otto centimetri quadrati.

Una piattaforma di imaging navale così confrontata con il decoder a compressione rapida dietro. Sarà abbastanza variabile per la citometria ad alto rendimento, l'analisi micro rara e le applicazioni di ricerca cellulare reale.