Piattaforma di microfluidica digitale basata su Electrowetting per l'analisi automatizzata di Immunosorbent legata all'enzima

Microfluidico digitale basato sull'elettrowetting è una tecnica che utilizza un cambiamento basato sulla tensione nell'angolo di contatto apparente di una goccia di microlitro-volume per facilitarne la manipolazione. La combinazione di questo con perline magnetiche funzionalizzate consente l'integrazione di più operazioni di unità di laboratorio per la preparazione del campione e l'identificazione di agenti patogeni utilizzando Immunosorbent Assay (ELISA) legato all'enzima.

L'automazione dell'attivazione di singole goccioline consente di portare sequenze complesse di un'unità di laboratorio in un unico chip. La nostra piattaforma microfluidica digitale affronta il rapido rilevamento specifico sul campo di agenti patogeni virali. Questo metodo si basa sul rilevamento quantitativo di antigeni specifici utilizzando microfluidica digitale basata sull'EWOD in combinazione con l'immunoprecipitazione magnetica.

In questo contributo, il metodo viene valutato rispetto a campioni contenenti varie concentrazioni di batteri, spore, virus e proteine. Questo processo è completamente automatizzato, sequenziale, scalabile e versatile. La sequenza e il volume delle goccioline possono essere modificati in base ai requisiti di un particolare protocollo.

Eludendo completamente il rilevamento basato sugli anticorpi, la piattaforma di microfluidica digitale potrebbe costruire su una potenziale applicazione basata sul biosensore dell'aptamero dove le perline magnetiche trasportano aptameri specifici per la cattura e il rilevamento di sequenze nucleotidiche. Quando si prova questa tecnica per la prima volta, è importante considerare il tipo di tensioattivo e come interagisce con la scelta della biochimica e il rivestimento polimerico idrofobico. Iniziare rimuovendo il magnete dalla microfluidica digitale o dalla piattaforma DMF e posizionandolo sul banco.

Posizionare una piastra di azionamento pulita sullo stadio rotante con il cromo rivolto verso l'alto, allineando la piastra con l'angolo superiore sinistro dello stadio incassato. Bloccare la piastra di azionamento dall'alto utilizzando il pannello con i 47 perni di contatto, che fissano la piastra in posizione e facilitano l'allineamento con i perni di contatto. Quindi placcare lo shim da 0,5 millimetri e il separatore PMMA di due millimetri sullo stadio rotante per fornire uno spazio controllato tra le piastre di attuazione e di copertura.

Per caricare le goccioline sulle pastiglie di carico proposte, aliquote quattro goccioline da 2,5 microliter dal tampone di corsa sui cuscinetti denotati B, A, R ed E utilizzando una goccia per tampone. Quindi aliquote 2,5 microlitri di soluzione di perossido di idrogeno luminol sul pad indicato E. Successivamente, i microlitri aliquoti 2,5 di Neutravidin coniugati rispettivamente con anticorpi secondari biotinilati HRP e microperline sui tamponi F, G e I indicato.

Infine, aliquote 2,5 microlitri del campione sconosciuto sul tampone indicato in C. Posizionare la piastra di copertura sulla superficie del carro accanto all'area di recesso rotonda e farla scorrere lateralmente nella rientranza e sopra la piastra di azionamento. Mettere il magnete permanente sopra la piastra di copertura e fissarlo facendo scorrere i due fermi, quindi ruotare il palco di 180 gradi e ispezionarlo visivamente per assicurarsi che le goccioline caricate siano ancora in posizione.

Verificare che la posizione di caricamento per ogni goccia corrisponda alla sequenza di azionamento programmata nel software. Posizionare la lattine schermata dal fotodetector nello slot dello stadio rotante e collegare il cavo. Posizionare il coperchio sulla piattaforma DMF e avviare la sequenza del programma utilizzando l'interfaccia software.

La posizione delle goccioline viene registrata tramite rilevamento capacitivo e può quindi essere osservata sull'interfaccia utente. La sequenza del programma richiederà messaggi che appaiono sull'interfaccia per informare l'operatore che la gocciolatura luminol è pronta a raccogliere le perline magnetiche estratte o la goccia di rilevamento è pronta per essere spostata nel sito di rilevamento. In entrambi i casi, è necessaria la conferma da parte dell'operatore per procedere.

L'intensità luminosa prodotta dalla reazione chemiluminescente viene letta dal fotodetettorio e registrata in tempo reale. Per operare in modalità visiva per l'ottimizzazione dei protocolli, avviare la sequenza di programma utilizzando l'interfaccia software. L'azionamento automatico delle goccioline può essere visualizzato sul chip per ciascuna delle fasi critiche del dosaggio, come l'estrazione magnetica delle perline, la resuspensione delle perline e la miscelazione.

Quando richiesto, montare la lattine schermata dal fotodetector nella fessura dello stadio rotante. Collegare il cavo del fotorivelante schermato può inserendo i perni nella presa. Posizionare il coperchio sulla piattaforma DMF e riprendere il saggio.

Le goccioline sono monitorate tramite rilevamento capacitivo e possono essere osservate sull'interfaccia utente. Per pulire l'apparecchiatura, aprire il coperchio della piattaforma DMF e ruotare lo stadio di 180 gradi. Srotoleggiare l'involucro del magnete e rimuovere il magnete dallo stadio rotante.

Rimuovere il wafer di silicio dallo scivolo con un paio di pinzette e sciacquarlo con acqua distillata. Quindi asciugarlo con aria compressa e posizionare in una piastra di Petri dove il wafer può essere conservato e riutilizzato. Utilizzare una micropipetta per rimuovere i rifiuti liquidi dal tampone senza toccare la superficie e pulire la superficie assorbendo il liquido dalla piastra di azionamento utilizzando carta assorbente.

Per studiare l'impatto della tensione di azionamento, una goccia dal buffer è stata azionata a varie tensioni di azionamento e il suo movimento è stato registrato. È stata dimostrata una correlazione tra Vrms e la velocità media ed è stato osservato un plateau di velocità dopo un certo valore di Vrms. La longevità della piastra di azionamento è stata ridotta quando sono stati utilizzati valori elevati per Vrms.

Per il funzionamento dell'unità di laboratorio di estrazione, la goccia contenente le perline sospese è stata spinta verso il sito di separazione al centro della zona di miscelazione. Quindi il magnete è stato attivato automaticamente per avvicinarsi al chip e mettere a fuoco le perline. Successivamente, la goccia è stata spostata verso la pastiglia dei rifiuti, lasciando le perline.

Le operazioni dell'unità di laboratorio di estrazione e miscelazione sul chip EWOD hanno facilitato una lavorazione miniaturizzata rapida e riproducibile del campione con rilevamento consecutivo degli agenti patogeni in 6-10 minuti. I tempi di incubazione e le concentrazioni coniugate sono stati variati per trovare le condizioni ottimali per il saggio. Si è scoperto che il tempo di incubazione di 160 secondi e la concentrazione coniugata di due microgrammi per millilitro hanno ottenuto il miglior rapporto segnale/rumore.

Le variazioni nel protocollo possono essere introdotte per raggiungere i livelli desiderati di automazione. L'ELISA in otto step è stato utilizzato per rilevare diversi antigeni come le spore bacillus atrophaeus e il batteriofago MS2. Nel frattempo, il protocollo in 10 step è stato utilizzato per quantificare E.coli.

È importante assicurarsi che le tensioni applicate, le concentrazioni di aliti e reagenti siano ottimali per l'attivazione delle goccioline e una corretta separazione magnetica sul chip. Per ottenere una misurazione precisa, si dovrebbe prendere in considerazione la capacità di legatura delle perline e potrebbero essere necessarie diluizioni seriali degli aliti. Scambiando il tipo di anticorpo, si possono rilevare diversi agenti patogeni da quello riportato nella sezione risultati.

Il metodo potrebbe essere applicato anche, ad esempio, per il rilevamento di biomarcatori o la diagnostica del punto di cura. Oltre alle applicazioni già presentate, il sistema è stato sviluppato tenendo presente il rilevamento sul campo dell'agente patogeno aerotrasportato. DMF è una piattaforma ideale per questa applicazione perché il volume delle goccioline corrisponde all'output di altri campionatori che abbiamo recentemente sviluppato.