Calcio Imaging funzionale nello sviluppo di reti corticali

L'obiettivo generale di questo film è dimostrare come misurare l'attività di rete dallo sviluppo di fette di cervello corticale utilizzando un indicatore fluorescente sensibile al calcio. Le fette di cervello DY sono costituite dalla corteccia enterale in via di sviluppo di un giovane topo. Sia i neuroni che gli astrociti sono carichi di marcatori calcio-dipendenti.

I cambiamenti nella fluorescenza dei coloranti calcio-dipendenti riflettono i cambiamenti nell'attività cellulare. Le cellule non neuronali, inclusi astrociti, microglia e cellule endoteliali, possono essere colorate utilizzando coloranti marcatori specifici. L'attività della rete corticale viene registrata utilizzando il time-lapse Le celle di imaging multifotone vengono rilevate all'interno della rete creando una pila 3D di immagini attraverso la regione di interesse.

I cambiamenti nella fluorescenza cellulare in più cellule possono quindi essere analizzati per leggere l'attività della rete corticale in via di sviluppo. Un modello distintivo di attività nel sistema nervoso in via di sviluppo è l'attività spontanea sincronizzata della rete. L'attività sincronizzata è stata osservata in molte diverse regioni neuronali in via di sviluppo, tra cui la corteccia del midollo spinale intatta e le preparazioni di coltura neuronale dissociate durante i periodi di attività spontanea dei neuroni, depolarizzati al fuoco, singoli picchi o esplosioni di potenziali d'azione che attivano molti canali del ferro, compresi i canali del calcio voltaggio-dipendenti che portano all'afflusso di calcio.

L'attività altamente sincronizzata è stata misurata da reti locali utilizzando elettrodi di campo o array multi-elettrodo. Questi consentono elevate frequenze di campionamento temporale, ma offrono una risoluzione spaziale inferiore a causa della lettura integrata dell'attività cellulare. La risoluzione dell'attività neurale da parte di una singola cellula è possibile utilizzando l'elettrofisiologia del patch clamp di singoli neuroni per misurare i tassi di attivazione.

Tuttavia, la capacità di misurare da una rete è limitata al numero di neuroni patchati contemporaneamente e in genere è solo uno o due neuroni. L'uso di coloranti indicatori fluorescenti calcio-dipendenti ha permesso di misurare l'attività sincronizzata attraverso una rete di cellule. Questa tecnica fornisce sia un'alta risoluzione spaziale che un campionamento temporale sufficiente per registrare l'attività spontanea della rete in via di sviluppo.

Gli indicatori fluorescenti sensibili al calcio come l'estere URA 2:00 AM contengono gruppi di acidi carbossilici che sono in grado di legare le mine di calcio. Questi coloranti fluorescenti sono attivati da specifiche lunghezze d'onda della luce utilizzando la microscopia a uno o due fotoni. Il numero di fotoni emessi dal colorante viene alterato transitoriamente al legame del calcio.

Questo cambiamento nel numero di fotoni o nella fluorescenza è riportato come segnale delta FF e corrisponde a un cambiamento nel livello di calcio all'interno del neurone. La misurazione dei cambiamenti negli indicatori sensibili al calcio è un'utile misura di lettura dei modelli di attività della rete nelle cellule in via di sviluppo. Ciao, sono Rianna Morty, e mi chiamo Julie Abbots.

Veniamo dal Dipartimento di Neurofisiologia Interpretativa e dall'università di Amsterdam. Abbiamo utilizzato l'imaging del calcio per studiare l'attività funzionale nello sviluppo del tessuto nella corteccia del topo utilizzando indicatori sensibili al calcio all'imaging multifocale. Lo scopo di questo breve filmato è quello di dimostrare come questi metodi possano essere utilizzati per misurare sia i modelli di attività spontanea che quelli evocativi nello sviluppo di reti nel sistema nervoso.

Rimuovi rapidamente il cervello dal cranio di un giovane topo per ridurre i danni ai circuiti neurali. Sezionare il cervello in una soluzione di fette ghiacciate. La soluzione di fetta contiene cloruro di colina invece del sodio comunemente usato in A TSF per le registrazioni neuronali.

In questi esperimenti, stiamo creando fette di cervello dalla corteccia enterale del cervello del topo in via di sviluppo. Metti un pezzo di carta da filtro sopra una capsula di Petro e bagna con qualche millilitro di A TSF. Trasferisci il cervello sul pezzo di carta da filtro.

Taglia in due gli emisferi usando una lama di rasoio a filo singolo. Separare i due emisferi. Rimettetene uno nella soluzione di fette ghiacciate con la semisfera rimanente.

Rimuovere il cervelletto con la lama del rasoio. Capovolgere una semisfera sulla sua linea mediana e praticare un taglio di circa un millimetro dalla superficie dorsale con un leggero angolo della lama verso l'estremità rostrale. Accendi il cervello.

La sua superficie tagliata di recente utilizzando un uccello di cotone e una spatola metallica. Trasferisci il cervello sul blocco di taglio del metallo. Spingi delicatamente il cervello fuori dalla spatola con un uccello di cotone sulla superficie incollata.

Fette di cervello da 300 micrometri vengono tagliate per i tessuti giovani, le velocità di taglio e la frequenza delle lame sono in genere più lente rispetto a quelle utilizzate per i tessuti più maturi. Una volta tagliata, trasferire ogni fetta utilizzando una pipetta di vetro. Le fette vengono trasferite nella camera di mantenimento, che contiene A TSF ossigenato a temperatura ambiente. L'A CSF contiene un rapporto più elevato tra magnesio e calcio rispetto alla soluzione di A CSF.

Utilizzato per la registrazione, le fette vengono lasciate recuperare per un'ora. Per caricare le celle con un indicatore calcio-dipendente o un marcatore specifico per la cellula, le fette devono essere trasferite in una camera per la procedura di colorazione. Sebbene siano disponibili camere commerciali, una può essere facilmente assemblata da apparecchiature di laboratorio standard a un costo molto basso.

Per realizzare una camera di colorazione, avrai bisogno delle seguenti attrezzature di laboratorio di base, due piastre di Petri in plastica, una siringa da 10 millilitri, una sezione di tubo di silice, un inserto per colture cellulari con una super colla a membrana semipermeabile, tre piccoli connettori per tubi e un ago a porta fine. Prendi la capsula di Petri grande e fai un piccolo foro con un'asta riscaldata attraverso la parete laterale. Prendi la piccola capsula di Petri e fai un foro di diametro simile abbastanza grande da consentire il passaggio del tubo di silicone.

Passare una sezione di tubo di silicone attraverso il foro e formare un anello all'interno del piattino. Usa la super colla per sigillare l'estremità aperta del tubo. Quindi attacca il resto del tubo alla parete interna della piccola capsula di Petri.

Metti la capsula di Petri piccola al centro di quella grande e incollala in posizione. Prendi l'estremità rimanente del tubo di silicone e passala attraverso il piccolo foro nella parete laterale della capsula di Petri. Prendi un ago sottile e fai dei piccoli fori nel tubo di silicone all'interno della capsula di Petri.

Praticare i fori a intervalli equidistanti per una fusione uniforme del gasper. Prelevare un pozzetto di coltura cellulare con una membrana semipermeabile utilizzando un bisturi riscaldato. Tagliare via il centimetro superiore del pozzetto per lasciare un piatto poco profondo per contenere le fette durante l'incubazione.

Posizionare il piatto fondo al centro del piattino circondato dal tubo di silicone poroso. Fare un foro di circa mezzo centimetro di diametro nel coperchio del piatto grande. Prendi una siringa di plastica da 10 millilitri usando un bisturi riscaldato.

Eseguire un taglio angolato per rimuovere l'estremità della siringa. Applicare la super colla sulla superficie tagliata del tubo della siringa. Attaccalo direttamente sopra il foro sul grande coperchio della capsula di Petri.

Collegare un connettore per tubi all'estremità della punta della siringa. Posizionare il piatto poco profondo al centro della piccola capsula di Petri, assicurandosi che il tubo poroso del gas sia disteso intorno al piatto. Questo tubo viene quindi collegato a un'alimentazione di gas carbogeno per ossigenare le fette.

Durante l'incubazione, riposizionare il coperchio del piatto grande, che è anche collegato direttamente all'alimentazione del gas tramite la punta della siringa. Questo porterà una scorta di auto e gas sulle fette durante l'incubazione per evitare lo sbiancamento del colorante. Tutte le procedure vengono eseguite con la minor luce possibile e sia la tintura che le fette vengono tenute al buio.

Riempire la camera di colorazione con circa un millilitro e mezzo di A TSF dal porta fette. Posizionare la camera di interfaccia all'interno e riempirla con un altro millilitro di A TSF. È importante mantenere un buon apporto di ossigeno per mantenere il tessuto sano e per un buon carico della fetta.

La colorazione avviene a circa 35 gradi C per facilitare l'assorbimento del colorante nei neuroni mentre la camera di colorazione si sta riscaldando. Preparare il colorante indicatore per fira 2:00 AM Ester. Aggiungere nove microlitri di DMSO con un microlitro di acido onico a una fiala da 50 microgrammi.

DMSO e acido onico. Agiscono come agenti permeanti per consentire l'assorbimento del colorante attraverso la membrana lipidica. Agitare la fiala per 15 minuti per assicurarsi che il colorante sia completamente sciolto.

Per la colorazione, trasferire ogni fetta nell'interfaccia. Inserire nella camera di colorazione. Accarezzare il colorante direttamente sulla regione di interesse sopra le fette, chiudere il coperchio della camera di colorazione.

Lasciare le fette incubate al buio per 20-40 minuti a seconda dell'età del maus utilizzato. Dopo l'incubazione, trasferisci nuovamente le fette nel portafette per lavare via il colorante in eccesso rimasto. I protocolli di colorazione per l'imaging del calcio possono essere adattati anche per i tessuti più vecchi.

Ciò richiede un'ulteriore fase di pre-incubazione. Trasferire le vecchie fette in una capsula di pre-incubazione poco profonda riempita con tre millilitri di liquido cerebrospinale e otto microlitri di crema quattro soluzione allo 0,5%Riscaldare a 35 gradi C per tre minuti. Quindi trasferire le fette nell'interfaccia, inserirle nella camera di colorazione e seguire le normali procedure di colorazione.

È anche possibile colorare queste fette per le cellule non neuronali, vale a dire astrociti, microglia e cellule endoteliali. La rumina di zolfo 1 0 1 può essere utilizzata per colorare gli astrociti per il domino di zolfo. Preparare una soluzione di 10 micromolari pipettare il colorante viola sulla regione di interesse nelle fette.

Lasciare incubare per un periodo di 15 minuti. Trasferire le fette nella camera di contenimento per rimuovere il colorante in eccesso. Il coniugato FSE della lectina di pomodoro può colorare per la microglia e le cellule endoteliali.

Per la lectina di pomodoro, preparare una soluzione di 20 microgrammi per millilitro. Accarezza il colorante sulla regione di interesse nelle fette. Lasciare incubare le fette per un periodo di 45 minuti.

Quindi trasferire nuovamente le fette nella camera di contenimento. Durante l'imaging, le fette devono essere stabili al microscopio. Di solito un'arpa metallica viene posizionata per tenere premuto il tessuto, tuttavia può distorcere in modo non uniforme la superficie della fetta fornendo solo un campo visivo limitato a fuoco per l'imaging da evitare.

Queste fette vengono incollate alla camera di registrazione utilizzando una soluzione di POLIETALINA o PEI. Il PEI è un polimero utilizzato per migliorare l'adesione delle cellule a una superficie per almeno un'ora. Prima di posizionare le fette nelle camere di registrazione, riempire queste camere con alcuni millilitri di soluzione di PEI per coprire il fondo della camera.

Per prima cosa, sciacquare via il PEI dalla camera con acqua distillata, seguito da una soluzione di liquido cerebrospinale. Trasferire una fetta nella camera di registrazione e rimuovere la soluzione di liquido cerebrospinale A in eccesso. Posizionare la fetta al centro della camera con un pennello fine.

Rimuovere tutto l'ulteriore A CSF utilizzando piccoli pezzi di carta da filtro assorbente. Fare attenzione che la fetta non abbia più A CSF attorno ai bordi. Infine, pettegola delicatamente mezzo millilitro di A CSF sulla fetta senza staccarla dalla camera.

Posizionare le camere in un grande contenitore di interfaccia ossigenato e lasciarle per un'altra ora al buio. I cambiamenti nei coloranti indicatori sensibili al calcio possono essere registrati con la microscopia a uno o due fotoni. Utilizziamo un laser in titanio zaffiro accoppiato a un microscopio Olympus per consentire l'imaging di due fotoni nelle nostre reti neuronali.

Inoltre, ci avvaliamo di un sistema di trim scope biotech L Vision con una telecamera MATSU con martello CCD EM per aumentare la velocità di scansione dei fotogrammi. Posizionare la camera a fette sotto il microscopio con un flusso stabile di A-T-S-F-A-T-S-F ossigenato contenente 1,6 millimolari di calcio e 1,5 millimolari. Il magnesio viene riscaldato a circa 30 gradi C nella configurazione utilizzando la luce bianca.

Individuate la regione di interesse nella fetta e concentratevi sulla superficie. Spegnere le luci e chiudere lo sportello dell'armadio di registrazione. Per ridurre i livelli di luce di fondo.

Sono disponibili diversi pacchetti software commerciali o aperti per registrare e analizzare le immagini Nel nostro laboratorio, utilizziamo il software di ispezione per l'acquisizione da Lavis Biotech. Per avviare l'imaging, selezionare la modalità della telecamera CCD per il rilevamento. Imposta la lunghezza d'onda rilevante per il tuo indicatore.

Per fira 2:00 AM Ester, impostiamo l'eccitazione a 820 nanometri nel software del cannocchiale di rifinitura. Selezionare la modalità di scansione 64 B. Scegli la dimensione, il campo visivo e la risoluzione in pixel ottimali per la tua regione di interesse.

Se necessario, selezionate una frequenza fotogrammi e una rotazione dei pixel appropriati per il campionamento dell'immagine. Aprire l'otturatore laser per l'imaging continuo. Utilizzo della modalità di imaging continuo.

Regola il guadagno e l'intensità del laser e concentrati sulla rete neuronale che desideri visualizzare. Interrompere la scansione. Seleziona le impostazioni time-lapse per la frequenza dei fotogrammi e la durata della sequenza.

Dopo l'imaging time-lapse, crea una pila Z di immagini che segnano 20 micron sopra e 20 micron sotto con incrementi di un micron. Questo stack Z viene utilizzato per il rilevamento delle celle durante l'analisi. Esporta i file registrati come una pila di immagini TIFF.

Per concludere, abbiamo dimostrato l'uso di indicatori di calcio per misurare l'attività di rete spontanea sincrona nella corteccia in via di sviluppo. Maggiori dettagli sulla metodologia e sui reagenti sono disponibili nelle schede tecniche che accompagnano questo film per consentire di impostare la tecnica nel proprio laboratorio.