Preparazione di acuta fette zona subventricolare for Imaging di calcio

Lo scopo di questa procedura è ottenere immagini dell'attività del calcio nelle cellule della zona subventricolare postnatale. Questo viene raggiunto innanzitutto rimuovendo con attenzione il tessuto cerebrale da un topo postnatale. Il secondo passaggio consiste nel preparare sezioni cerebrali acute vitali contenenti la zona subventricolare.

Successivamente, le sezioni cerebrali vengono caricate con un colorante sensibile al calcio. L'ultimo passaggio consiste nell'acquisire immagini dell'attività mediante un microscopio confocale a intervalli di tempo. In definitiva, l'acquisizione di immagini a intervalli di tempo dell'attività calcica nelle cellule della zona ventricolare viene utilizzata per mostrare la dinamica dell'attività intercellulare e rivelare i modelli di comunicazione tra diversi tipi cellulari e la vascolarizzazione.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neurogenesi, come il modo in cui i diversi tipi cellulari comunicano tra loro e come le cellule possano influenzare la vascolarizzazione dopo l'eutanasia e la decapitazione di un topo di età compresa tra P20 e P30. Secondo le linee guida approvate a livello istituzionale, posizionare la testa in un vassoio contenente soluzione per dissezione. Stabilizzare la testa con pinzette e utilizzare forbici microchirurgiche per effettuare tagli continui intorno al cranio e lungo la linea mediana.

Assicurarsi che il bulbo olfattivo rimanga attaccato al cervello e non venga danneggiato. Eseguire dei tagli sulla faccia dorsale e quindi utilizzare una pinzetta per rimuovere l'osso sovrastante dal cervello. Successivamente, mantenendo ancora la testa con la pinzetta, utilizzare una lama chirurgica per effettuare un taglio coronale al livello di lambda.

Utilizzare lo stesso bisturi per effettuare tagli sagittali su entrambi i lati del cervello, a circa due-tre millimetri lateralmente rispetto alla linea mediana. Quindi utilizzare il bisturi per sollevare delicatamente il cervello dal basso ed estrarlo completamente dal cranio. L'intera procedura fino a questo punto deve essere completata in meno di tre minuti.

Applicare una piccola quantità di colla istantanea a base di cianoacrilato sulla piastra del vibram. Quindi prendere il tessuto cerebrale e montarlo su uno dei lati piatti creati dal taglio sagittale laterale. Il montaggio di un blocco di agarosio per stabilizzare il tessuto durante il taglio è facoltativo.

Risciacquare la lama vibram con etanolo per rimuovere le sostanze oleose, quindi risciacquare con acqua distillata. Inserire la lama nel supporto della lama e montare il supporto sulla vibrazione. Impostare il vibratore in modo da tagliare fette di tessuto con uno spessore compreso tra 250 e 350 micron, utilizzando una vibrazione ad alta frequenza e una velocità bassa per sezionare progressivamente il tessuto.

L'aspetto del bulbo olfattivo è un buon indicatore del fatto che le sezioni sagittali si stanno avvicinando alla zona subventricolare. L'aspetto dei ventricoli e l'ispessimento del corpo calloso sono anche essi ottimi indicatori della successiva comparsa della zona subventricolare. Una volta raggiunta la zona subventricolare, utilizzare una pipetta di plastica per pasta con la punta tagliata per rimuovere ogni sezione e trasferirla in una camera di mantenimento per sezioni.

Con A CSF. Le sezioni richiedono un'incubazione di un'ora in A CSF. Durante questo periodo, è possibile preparare le pipette, il colorante e il microscopio per i successivi passaggi di acquisizione delle immagini.

Per preparare le pipette, tirare da sei a otto pipette di vetro in modo che ciascuna abbia una lunghezza della punta di circa due millimetri e un diametro di due-tre micron. Inoltre, il supporto per pipetta è preimpostato con un angolo di circa 16 gradi, in modo che la pipetta possa essere montata senza toccare la camera di perfusione o interferire con il posizionamento dell'obiettivo. Per preparare il colorante per il calcio, aggiungere 4,6 microlitri di onic F1 27, soluzione al 20% in DMSO a un’aliquota di 50 microgrammi di flu oh four.

Infine, per preparare la pompa peristaltica, il cui utilizzo aiuta a minimizzare la deriva dell'immagine, far scorrere un liquido cerebrospinale attraverso i tubi di perfusione e assicurarsi che i tubi siano privi di bolle. Posizionare ora la punta del vuoto per assicurarsi che la soluzione venga aspirata dalla camera di perfusione. Questa immagine mostra il setup del sistema di perfusione.

La soluzione deve raggiungere un livello adeguato per immergere l'obiettivo alla corretta distanza di lavoro, ma non così alto da far traboccare la soluzione dai lati della camera. Ascoltare la costanza del flusso per verificare un'aspirazione costante necessaria per applicare il colorante di carico mediante il metodo del bagno. Per prima cosa, preparare da uno a due millilitri di soluzione di lavoro del colorante da quattro a cinque micromolari diluendo la soluzione madre.

In un CSF, trasferire le sezioni in una piastra da coltura da 35 millimetri con fondo a maglia riempita con CSF. Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica da tre millilitri per rimuovere delicatamente il CSF, aggiungendo contemporaneamente la soluzione di lavoro del colorante per il calcio. Quindi incubare a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti in un ambiente controllato con anidride carbonica al 5%.

Dopo l'incubazione, riposizionare la sezione nella camera di mantenimento riempita con A CSF per rimuovere il colorante non penetrato nelle cellule. Dopo 30 minuti in A CSF, trasferire la sezione nella camera di perfusione per l'applicazione del colorante mediante pressione. Trasferire una sezione dalla camera di mantenimento alla camera di perfusione montata sul microscopio.

Quindi riempire nuovamente la pipetta di vetro con una soluzione di lavoro del colorante da 250 micromolari. Assicurarsi che la punta della pipetta sia priva di bolle d'aria e posizionata sul micromanipolatore. Abbassare ora la pipetta sulla regione di interesse.

La pipetta può essere posizionata in modo che la punta si trovi a diverse micrometri sopra la superficie tagliata, oppure a diverse micrometri sotto la superficie, ma lontano dalla regione registrata. Impostare il pico spritzer in modo da erogare meno di tre libbre per pollice quadrato ed applicare il colorante per uno o due minuti. Potrebbero essere necessarie applicazioni ripetute, a seconda dell'etichettatura valutata ad occhio.

Quando applicato sulla superficie della sezione, questo protocollo etichetterà in modo preferenziale i neuroblasti; quando applicato al di sotto della superficie, questa tecnica etichetterà in modo preferenziale gli astrociti, ma se applicato per più di tre minuti a una concentrazione di 500 micromolare, verranno etichettati i neuroblasti. Indipendentemente dalla posizione della punta della pipetta, lasciare che la sezione si lavi e riprenda in un liquido CSF per 30-45 minuti. Individuare la regione di interesse utilizzando un obiettivo a basso ingrandimento, quindi passare a un obiettivo a immersione in acqua ad alto ingrandimento e valutare lo stato di salute delle cellule nella regione di interesse.

Con un contrasto di interferenza differenziale, le cellule sane appaiono rotonde e rigonfie e mostrano un debole carico di flu oh quattro. Dopo aver verificato che la perfusione e il vuoto funzionano adeguatamente, impostare la risoluzione temporale e la risoluzione spaziale ai valori desiderati. In questo caso, un fotogramma viene acquisito approssimativamente ogni secondo con una risoluzione di cinquecentododici per cinquecentododici pixel.

Dopo aver impostato la durata da due a 10 minuti, avviare la corsa. Gli agenti farmacologici vengono lavati per cinque-dieci minuti e quindi rimossi per ulteriori cinque-dieci minuti. Questa immagine media rappresentativa, ottenuta da una registrazione a scatti dell'attività del calcio, è stata acquisita dopo gli astrociti nella zona subventricolare.

Sono stati caricati con pressione. Applicazione di flu oh 4:00 AM in profondità nella sezione. I filmati sono stati acquisiti a 0,5.

In un secondo momento, le regioni di interesse vengono posizionate sulle cellule che mostrano attività. Di seguito sono riportati i tracciati delle regioni di interesse numerate mostrate in precedenza. I tracciati sono stati filtrati mediante una media mobile e normalizzati.

La scala verticale rappresenta due volte delta F su F zero, dove F è l'intensità del segnale e F zero è il segnale medio di base, e delta F è uguale a F meno F zero. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro o cinque ore se svolta correttamente.