Preparazione di acuta fette zona subventricolare for Imaging di calcio

Lo scopo di questa procedura è quello di visualizzare l'attività calcica delle cellule nella zona subventricolare postnatale. Ciò si ottiene rimuovendo prima con cura il tessuto cerebrale da un topo postnatale. Il secondo passo consiste nel creare fette di cervello acute vive contenenti la zona subventricolare.

Successivamente, le fette di cervello vengono caricate con un colorante sensibile al calcio. Il passaggio finale consiste nell'visualizzare l'attività con un microscopio confocale time-lapse. In definitiva, l'imaging time-lapse dell'attività del calcio nelle cellule della zona ventricolare viene utilizzato per mostrare le dinamiche dell'attività intercellulare e rivelare i modelli di comunicazione tra i diversi tipi di cellule e il sistema vascolare.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neurogenesi, come ad esempio come i diversi tipi di cellule comunicano tra loro e come le cellule possono influenzare la vascolarizzazione dopo aver sacrificato e decapitato un cucciolo di topo da P 20 a P 30. Secondo le linee guida approvate istituzionalmente, posizionare la testa in un campo portamaschere con soluzione di dissezione. Stabilizza la testa con una pinza e usa le micro forbici per eseguire tagli continui attorno al cranio e alla linea mediana.

Assicurarsi che il bulbo olfattivo rimanga attaccato al cervello e non venga danneggiato. Fai dei tagli sul lato dorsale e poi usa il forcipe per rimuovere il cranio sovrastante dal cervello. Quindi, tenendo ancora la testa con una pinza, utilizzare una lama chirurgica per eseguire un taglio coronale a livello della lambda.

Usa la stessa lama di rasoio per fare tagli sagittali su entrambi i lati del cervello di circa due o tre millimetri lateralmente alla linea mediana. Quindi usa la lama per scavare sotto il cervello e rimuoverlo completamente dal cranio. La procedura fino a questo punto dovrebbe essere eseguita in meno di tre minuti.

Posizionare una piccola quantità di super colla a base di cianoacrilato sulla piastra del vibram. Quindi prelevare il tessuto cerebrale e montarlo su uno dei lati piatti creati dal taglio sagittale laterale. Il montaggio di un blocco di agarosio per stabilizzare il tessuto durante il taglio è facoltativo.

Sciacquare la lama vibram con etanolo per rimuovere gli oli e poi risciacquare con acqua distillata. Posizionare la lama nel portalama e montare il portalama sul vibratore. Impostare il vibratore in modo che le fette di tessuto vengano tagliate a uno spessore compreso tra 250 e 350 micron con vibrazioni ad alta frequenza e sezioni progressive a bassa velocità attraverso il tessuto.

L'aspetto del bulbo olfattivo è un buon indicatore che le sezioni sagittali si stanno avvicinando alla zona subventricolare. Anche l'aspetto dei ventricoli e l'ispessimento del corpo calloso sono buoni indicatori della successiva comparsa della zona subventricolare. Una volta raggiunta la zona sottoventricolare, utilizzare una pipetta per pasta di plastica con il taglio della punta per rimuovere ogni fetta e trasferirla in una camera di contenimento delle fette.

Con un CSF. Le fette richiedono un'ora di incubazione in A CSF. Durante questo periodo, le pipette, il colorante e il microscopio possono essere preparati per le successive fasi di imaging.

Per preparare le pipette, tirare da sei a otto pipette di vetro in modo che ciascuna abbia una lunghezza della punta di circa due millimetri e un diametro di due o tre micron. Inoltre, il portapipetta è preimpostato con un angolo di circa 16 gradi, in modo che la pipetta possa essere montata senza entrare in contatto con la camera di perfusione o interferire con il posizionamento dell'obiettivo. Per preparare il colorante di calcio, aggiungere 4,6 microlitri di soluzione di onic F1 27,20% in DMSO a un'aliquota di 50 microgrammi di flu oh four.

Infine, per preparare la pompa peristaltica, il cui uso aiuta a ridurre al minimo la deriva dell'immagine, eseguire un liquido cerebrospinale attraverso le linee di perfusione e assicurarsi che le linee siano prive di bolle. A questo punto, posizionare la punta del vuoto in modo che la soluzione venga aspirata dalla camera di perfusione. Questa immagine mostra la configurazione del sistema di perfusione.

La soluzione deve essere a un livello adeguato per immergere l'obiettivo alla corretta distanza di lavoro, ma non così alta da far traboccare la soluzione sui lati della camera. Ascoltare la stabilità per verificare un'aspirazione costante ad applicare il colorante di carico tramite il metodo del bagno. Innanzitutto, preparare da uno a due millilitri della soluzione di lavoro del colorante micromolare da quattro a cinque diluendo la soluzione madre.

In A CSF, trasferire le fette in un piatto coltivato da 35 millimetri con un fondo a rete riempito con A CSF. Utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica da tre millilitri per rimuovere delicatamente l'A CSF e contemporaneamente aggiungere la soluzione di lavoro del colorante di calcio. Quindi incubare a 37 gradi Celsius per 30-60 minuti in un ambiente controllato con gas di anidride carbonica al 5%.

Dopo l'incubazione, riposizionare la fetta nella camera di contenimento riempita di A CSF per lavare via il colorante che non è entrato nelle cellule. Dopo 30 minuti in A CSF, trasferire la fetta nella camera di perfusione per l'applicazione a pressione del colorante. Trasferire una fetta dalla camera di mantenimento alla camera di perfusione sul microscopio.

Quindi riempire nuovamente la pipetta di vetro con 250 micromolari di soluzione di lavoro colorante. Assicurarsi che il puntale della pipetta sia privo di bolle e posizionato sul micromanipolatore. Ora abbassate la pipetta nella regione di interesse.

La pipetta può essere posizionata in modo che il puntale si trovi diversi micrometri sopra la superficie affettata, oppure sepolto diversi micrometri sotto la superficie, ma lontano dalla regione registrata. Imposta lo spritz pico in modo che fornisca meno di tre libbre per pollice quadrato e applica la tintura per uno o due minuti. Possono essere necessarie applicazioni ripetute a seconda dell'etichettatura valutata a occhio.

Quando applicato sulla superficie della fetta, questo protocollo etichetterà preferenzialmente i neuroblasti quando applicato sotto la superficie, questa tecnica etichetterà preferenzialmente gli astrociti, ma se applicato per più di tre minuti a una concentrazione di 500, il neuroblasto micromolare sarà etichettato. Indipendentemente dal posizionamento della punta della pipetta, lasciare che la fetta si lavi e si riprenda in A CSF per 30-45 minuti. Individua la regione di interesse con un obiettivo di potenza inferiore, quindi passa a un obiettivo di immersione in acqua di potenza superiore e valuta lo stato di salute delle celle nella regione di interesse.

Sotto un contrasto di interferenza differenziale, le cellule sane appaiono rotonde e paffute e mostrano un debole carico influenzale o quattro. Dopo aver verificato che la perfusione e il vuoto funzionino adeguatamente, impostare la risoluzione time-lapse e la risoluzione spaziale alle velocità desiderate. In questo caso, viene ripreso un fotogramma circa ogni secondo con una risoluzione di cinque 12 x cinque da 12 pixel.

Dopo aver impostato la durata da due a 10 minuti, avviare la corsa. Gli agenti farmacologici vengono lavati per 5-10 minuti e poi lavati per altri 5-10 minuti. Questa immagine media rappresentativa da una registrazione time-lapse dell'attività del calcio è stata scattata dopo gli astrociti nella zona subventricolare.

Erano carichi di pressione. Applicazione dell'influenza oh 4:00 AM in profondità nella fetta. I film sono stati acquisiti a 0,5.

In secondo luogo, le regioni di interesse vengono posizionate sopra le cellule che mostrano attività. Ecco le tracce delle regioni numerate di interesse mostrate in precedenza. Le tracce sono state filtrate con una media mobile e normalizzate.

La scala verticale rappresenta due volte il delta F su F zero, dove F è l'intensità del segnale, F zero è il segnale medio di base e il delta F è uguale a F meno F zero. Una volta padroneggiato. Questa tecnica può essere eseguita in quattro o cinque ore se eseguita correttamente.