Creazione di una densa trasposone inserimento Biblioteca mediante coniugazione batterica Enterobacterial ceppi come Escherichia Coli e Shigella flexneri

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è creare una libreria ad alta densità di inserzioni di trasposone in Escherichia coli o Shigella flexneri utilizzando la coniugazione batterica. Questa tecnica permette di generare centinaia di migliaia di mutanti batterici unici attraverso l'inserzione casuale nel genoma di un trasposone Tn10. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il trasferimento del plasmide contenente il trasposone avviene mediante coniugazione batterica, anziché con altri metodi meno efficienti, come l'elettroporazione.

Inoltre, il trasposone Tn10 stesso si inserisce nel genoma con un bias minore rispetto ad altri trasposoni. Utilizzando una tecnica sterile, aggiungere un millilitro di coltura ottenuta nella notte del ceppo donatore in un tubo eppendorf sterile. Il tubo dovrebbe essere etichettato, ad esempio, con una D, per indicare il donatore.

Eseguire la stessa procedura per il ceppo ricevente, prelevando un millilitro di coltura notturna del ceppo ricevente in una provetta eppendorf sterile. Ancora una volta, ad esempio, etichettata con R, per ricevente. Centrifugare entrambe le provette per un minuto a 14.000 ×g a temperatura ambiente.

Questo può essere eseguito con una centrifuga da banco. Mentre la centrifuga è in funzione, preparare i filtri per la coniugazione. Utilizzare pinze sterili per posizionare un filtro in nitrocellulosa su una piastra di agar LB etichettata contenente nessun antibiotico.

In alternativa, al posto del filtro in nitrocellulosa, può essere utilizzata carta da trasferimento sterile. Posizionare ciascun filtro su una piastra separata di agar LB per ridurre al minimo la contaminazione. Assicurarsi che ciascun filtro sia posizionato su una piastra di agar LB opportunamente etichettata.

Preparare tre piastre, ciascuna contenente un filtro. Una per il ceppo donatore, una per il ceppo ricettore e una per la libreria. Una volta terminata la centrifuga, rimuovere le colture in coltura notturna.

Rimuovere tutti i mezzi di crescita contenenti antibiotici dal tubo eppendorf e smaltirli. Prestare attenzione a non disturbare il pellet di cellule batteriche, cercando al contempo di eliminare tutto il mezzo di crescita. Assicurarsi di lavorare in condizioni asettiche e di cambiare i puntali tra ogni campione.

In ogni provetta eppendorf, aggiungere 110 microlitri di terreno LB fresco senza antibiotici e pipettare su e giù per risospendere la coltura. Assicurarsi di lavorare in condizioni asettiche. Pipettare su e giù più volte per verificare che non rimangano grumi cellulari.

Questo passaggio viene eseguito per concentrare la coltura batterica ed eliminare eventuali antibiotici residui dalla coltura notturna. Utilizzando una pipetta, posizionare 50 microlitri della coltura concentrata del donatore sul filtro etichettato come Donatore. Aggiungere lentamente i 50 microlitri sul filtro, aggiungendoli goccia a goccia.

Fare lo stesso per il ceppo ricevente, aggiungendo 50 microlitri della coltura risospesa, la coltura risospesa concentrata sul filtro del ricevente in modo goccia a goccia. Per consentire la coniugazione, sia il ceppo ricevente che il ceppo donatore vengono aggiunti allo stesso filtro di carta in modo da essere a stretto contatto fisico. Per fare ciò, aggiungere 50 microlitri sia del ceppo donatore che del ceppo ricevente allo stesso filtro sulla piastra etichettata come libreria.

Posizionare queste piastre di agar contenenti i filtri a 37 gradi per sei ore. Il processo di coniugazione avviene in sei ore a 37 gradi Celsius. Durante la coniugazione, il plasmide pJA1 passa nel ceppo ricevente.

Dopo la coniugazione, i batteri vengono separati dal filtro mediante vortex e indotti con un millimolare di IPTG. L'IPTG induce la transposasi e il transposone contenente il gene di resistenza alla canamicina viene inserito casualmente nel genoma del ceppo ricettore. I batteri vengono seminati su piastre di agar LB contenenti canamicina e un altro antibiotico per selezionare il ceppo ricettore contenente il transposone.

Il ceppo ricevente è negativo per Lambda pir, quindi il plasmide pJA1 viene perso. Dopo sei ore di crescita a 37 gradi Celsius, la coniugazione è completa. Rimuovere le piastre contenenti i filtri dall'incubatrice.

Utilizzare pinze sterili per rimuovere il filtro contenente il controllo negativo del donatore dalla piastra di agar LB. Tamporre il tubo per far scendere il filtro in fondo alla provetta conica ed assicurarsi che il filtro sia completamente immerso nel mezzo LB. Questo tubo contiene due millilitri di mezzo LB con IPTG e una concentrazione finale di un millimolare.

Vortexare il tubo per un minuto per dissociare i batteri dal filtro in nitrocellulosa. Il terreno LB dovrebbe diventare torbido a causa delle cellule batteriche. Ripetere questa procedura anche per il controllo del ricevente e per la libreria.

Dopo aver vortexato accuratamente i filtri contenenti le cellule batteriche per dissociare i batteri dal filtro, le cellule batteriche vengono seminate su terreni selezionati. A questo passaggio, i batteri vengono seminati su piastre di agar LB contenenti kanamicina e un altro antibiotico, come l'acido nalidixico. La kanamicina viene utilizzata per selezionare le cellule riceventi in cui il trasposone contenente il marcatore di resistenza alla kanamicina si è integrato con successo nel genoma.

Le cellule riceventi che non hanno integrato il marcatore nel genoma vengono eliminate mediante selezione. Un altro antibiotico, come l'acido nalidixico, viene utilizzato per selezionare contro il ceppo donatore. Il ceppo donatore utilizzato in questo caso è sensibile all'acido nalidixico, mentre il ceppo ricevente è resistente all'acido nalidixico.

Utilizzando questo secondo antibiotico, è possibile eliminare il ceppo donatore. A questo punto, è necessario piastrare diverse diluizioni per determinare la diluizione della libreria che produce molte colonie adeguatamente distanziate. Dopo aver contato e registrato il numero di colonie su tutte le piastre contenenti la libreria di trasposone, alcuni utenti potrebbero voler raggruppare o combinare la libreria in un unico tubo.

Questa operazione può essere eseguita utilizzando un'apposita spatola sterile. Aggiungere un millilitro di terreno LB alla piastra di agar LB contenente la libreria di transposoni. Una volta aggiunto il terreno alla piastra, utilizzare la spatola sterile per raschiare e disperdere i batteri dalla superficie della piastra.

Spesso non è possibile rimuovere tutti i batteri dalla piastra. Rimuovere la sospensione batterica e collocarla in un tubo conico da 50 ml o 15 ml. Ripetere l'operazione per tutte le piastre.

Dopo aver raschiato tutte le piastre, vortexare la sospensione batterica combinata per un minuto completo al fine di rompere eventuali aggregati cellulari. Questa sospensione costituisce ora la libreria combinata. Dopo la crescita a 37 gradi per 18 ore, non dovrebbe esserci crescita sulle piastre di controllo del donatore o del ricettore.

Le piastre contenenti la libreria di mutanti dovrebbero idealmente presentare numerose colonie di diverse dimensioni. Dimensioni variabili delle colonie indicano cloni con diversa fitness ed è un buon segno che il protocollo ha funzionato. La creazione di una libreria densa di mutagenesi mediante trasposone nei batteri può risultare vantaggiosa per molteplici applicazioni successive, che vanno dalla scoperta di geni di virulenza e patogeni batterici allo studio dei geni essenziali fino all'identificazione di reti di interazioni genetiche.

Tutte queste applicazioni successive si basano sulla costruzione di una libreria densa di inserzioni di trasposone. Il metodo qui presentato fornisce una procedura semplice, rapida ed economica per ottenere una libreria di trasposone molto densa in ceppi di enterobatteri come E coli o Shigella flexneri.