Creazione di una densa trasposone inserimento Biblioteca mediante coniugazione batterica Enterobacterial ceppi come Escherichia Coli e Shigella flexneri

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di creare una libreria di inserzione di trasposoni ad alta densità in Escherichia coli o Shigella flexneri utilizzando la coniugazione batterica. Questa tecnica consente la creazione di centinaia di migliaia di mutanti batterici unici mediante l'inserimento genomico casuale di un trasposone Tn10. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il trasferimento del plasma all'alloggiamento del trasposone avviene tramite coniugazione batterica invece di altri metodi meno efficienti, come l'elettroporazione.

Inoltre, il trasposone Tn10 stesso si inserisce nel genoma con meno distorsioni rispetto ad altri trasposoni. Utilizzando una tecnica sterile, aggiungere un millilitro di coltura notturna del ceppo donatore in una provetta Eppendorf sterile. La tuba deve essere etichettata, ad esempio, con una D, per donatore.

Fare lo stesso per il ceppo ricevente, rimuovendo un millilitro di coltura notturna del ceppo ricevente in una provetta Eppendorf sterile. Ancora una volta, ad esempio, etichettato con R, per destinatario. Centrifugare entrambe le provette per un minuto a 14.000 volte G a temperatura ambiente.

Questo può essere fatto in una centrifuga da banco. Mentre la centrifuga è in funzione, preparare i filtri per la coniugazione. Utilizzare una pinza sterile per posizionare un filtro in nitrocellulosa su una piastra di agar LB etichettata che non contiene antibiotici.

In alternativa, al posto del filtro alla nitrocellulosa, si può utilizzare carta assorbente sterile. Posizionare ciascun filtro su una piastra di agar LB separata per ridurre al minimo la contaminazione. Assicurarsi che ogni filtro sia posizionato su una piastra di agar LB adeguatamente etichettata.

Prepara tre piastre, ciascuna contenente un filtro. Uno per il ceppo donatore, uno per il ceppo ricevente e uno per la biblioteca. Una volta terminata la centrifuga, rimuovere le colture notturne.

Rimuovere tutti i terreni di coltura contenenti antibiotici dalla provetta di eppendorf e gettarli. Fare attenzione a non interrompere o disturbare la tavolozza cellulare batterica, ma cercare di rimuovere tutti i mezzi di crescita. Assicurati di lavorare in modo asettico e di cambiare i puntali tra un campione e l'altro.

A ciascuna provetta Eppendorf, aggiungere 110 microlitri di terreno LB fresco senza antibiotici e pipettare su e giù per risospendere la coltura. Assicurati di lavorare in modo asettico. Pipettando su e giù più volte per assicurarsi che non rimangano grumi di cellule.

Questo passaggio viene eseguito per concentrare la coltura batterica e rimuovere eventuali antibiotici rimasti dalla coltura notturna. Utilizzando una pipetta, posizionare 50 microlitri di coltura concentrata del donatore sul filtro etichettato Donatore. Aggiungere lentamente i 50 microlitri al filtro a goccia.

Fare lo stesso per il ceppo ricevente aggiungendo 50 microlitri di coltura risospesa, la coltura risospesa concentrata sul filtro ricevente in modo gocce. Affinché avvenga la coniugazione, sia il ceppo ricevente che il ceppo donatore vengono aggiunti alla stessa carta da filtro in modo che siano a stretto contatto fisico. Per fare ciò, aggiungere 50 microlitri sia del ceppo donatore che del ceppo ricevente allo stesso filtro sulla libreria etichettata per piastra.

Posizionare queste piastre di agar contenenti i filtri a 37 gradi per sei ore. Il processo di coniugazione avviene nell'arco di sei ore a 37 gradi Celsius. Durante la coniugazione, la plasmina pJA1 si sposta nel ceppo ricevente.

Dopo la coniugazione, i batteri vengono dissociati dal filtro mediante vortice e indotti con un millimolare IPTG. L'IPTG induce la trasposasi e il trasposone contenente il gene per la resistenza alla kanamicina viene inserito in modo casuale nel genoma del ceppo ricevente. I batteri vengono piastrati su piastre di agar LB contenenti kanamicina e un altro antibiotico da selezionare per il ceppo ricevente contenente il trasposone.

Il ceppo ricevente è Lambda pir negativo, quindi la plasmina pJA1 viene persa. Dopo sei ore di crescita a 37 gradi Celsius, la coniugazione è completa. Rimuovere le piastre contenenti i filtri dall'incubatrice.

Utilizzare una pinza sterile per rimuovere il filtro contenente il controllo negativo del donatore dalla piastra di agar LB. Battere il tubo per portare la carta da filtro sul fondo della fiala conica e assicurarsi che il filtro sia completamente immerso nel media LB. Questa provetta contiene due millilitri di terreno LB con IPTG e una concentrazione finale di un millimolare.

Agitare il tubo per un minuto per dissociare i batteri dal filtro nitrocellulosa. Il terreno LB dovrebbe diventare torbido con cellule batteriche. Ripetere l'operazione anche per il controllo destinatario e per la libreria.

Dopo che i filtri contenenti le cellule batteriche sono stati accuratamente vorticizzati per dissociare i batteri dal filtro, le cellule batteriche vengono piastrate su mezzi selezionati. In questa fase, i batteri vengono placcati in piastre di agar LB contenenti kanamicina e un altro antibiotico come l'acido nalidixico. La kanamicina viene utilizzata per selezionare le cellule riceventi che hanno il trasposone contenente il marcatore di resistenza alla kanamicina integrato con successo nel genoma.

Le cellule riceventi che non hanno avuto il marcatore integrato nel genoma vengono selezionate in base a quelle che sono state selezionate. Un altro antibiotico come l'acido nalidixico viene utilizzato per selezionare contro il ceppo del donatore. Il ceppo donatore utilizzato qui è sensibile all'acido nalidixico, mentre il ceppo ricevente è resistente all'acido nalidixico.

Utilizzando questo secondo antibiotico, è possibile rimuovere il ceppo del donatore. A questo punto, diverse diluizioni devono essere piastrate per determinare una diluizione della libreria che produce molte colonie adeguatamente distanziate. Dopo aver contato e registrato il numero di colonie su tutte le piastre contenenti la libreria dei trasposoni, alcuni utenti potrebbero voler raggruppare o combinare la libreria in un unico tubo.

Questo può essere fatto utilizzando uno spandiconcime sterile. Aggiungere un millilitro di terreno LB alla piastra di agar LB contenente la libreria dei trasposoni. Una volta che il terreno è stato aggiunto alla piastra, utilizzare lo spalmatore sterile per raschiare e dissociare i batteri dalla piastra.

Spesso non è possibile rimuovere tutti i batteri dal piatto. Rimuovere la sospensione batterica e metterla in una fiala conica da 50 mil o 15 mil. Ripetere l'operazione per tutti i piatti.

Una volta che tutte le piastre sono state raschiate, agitare la sospensione batterica accumulata per un minuto intero per rompere eventuali grumi di cellule. Questo costituisce ora la libreria in pool. Dopo la crescita a 37 gradi per 18 ore, non dovrebbe esserci crescita sulle piastre di controllo del donatore o del ricevente.

Le piastre contenenti la libreria mutante contengono idealmente molte colonie con una varietà di dimensioni. Diverse dimensioni delle colonie indicavano cloni di diversa fitness e sono un buon segno che il protocollo ha funzionato. La creazione di una densa libreria di mutagenesi dei trasposoni nei batteri è potenzialmente vantaggiosa per molte applicazioni a valle, che vanno dalla scoperta di geni di virulenza e patogeni batterici allo studio di geni essenziali all'identificazione di reti di interazione genetica.

Tutte queste applicazioni a valle si basano sulla costruzione di una densa libreria di inserzione di trasposoni. Il metodo qui presentato fornisce una procedura semplice, veloce ed economica per creare una libreria di trasposoni molto densa in ceppi enterobatterici come E coli o Shigella flexneri.