Integrazione transgenica sito-diretta mediata da phiC31-integrasi: una tecnica di microiniezione per l'integrazione di transgeni sito-specifici in un vettore di anofele

L'integrasi phiC31 è un enzima ricombinasi derivato dai fagi che catalizza la ricombinazione sito-specifica di un transgene, un gene estraneo, in un genoma ospite. Per l'integrazione del transgene in un ospite di Anopheles, iniziare con un embrione di Anopheles in un tampone adatto.

Il genoma di Anopheles è pre-ingegnerizzato con un sito di attacco per l'integrazione genica e un marcatore ciano-fluorescente per la selezione visiva. Successivamente, aggiungere a una fiala un piccolo volume di plasmide donatore che trasporta il carico transgenico desiderato, un sito di attacco, un marcatore fluorescente rosso e i componenti della spina dorsale del plasmide. Quindi, aggiungere un volume ottimale di un plasmide helper che trasporta un'integrasi codificante un gene. Ora, caricare la miscela plasmidica in una microsiringa.

Iniettare delicatamente i plasmidi nel polo posteriore dell'embrione, il sito di origine delle cellule germinali, provocando un leggero movimento del citoplasma. Una volta all'interno dell'embrione, il plasmide helper inizia a sintetizzare gli enzimi integrasi.

L'enzima integrasi media la ricombinazione sito-specifica tra il plasmide donatore e il genoma ospite. Pertanto, il transgene e il marcatore fluorescente rosso del plasmide donatore si integrano all'interno dei siti di attacco ricombinanti nel genoma di Anopheles. Successivamente, incubare l'embrione iniettato in condizioni fisiologiche per la schiusa, con vortice intermittente.

In pochi giorni, l'embrione si schiude in una larva. Al microscopio a fluorescenza, la larva di Anopheles con geni integrati con successo esprime sia la fluorescenza ciano, che marca il genoma ospite, sia la fluorescenza rossa, che marcano il transgene dal plasmide donatore.

Purifica i plasmidi donatori e helper utilizzando un kit di purificazione privo di endotossine. Combinare il plasmide donatore marcato con attB che trasporta il transgene di interesse e il plasmide helper che trasporta l'integrasi, per ottenere una miscela con una concentrazione finale di 350 nanogrammi per microlitro del plasmide donatore e 150 nanogrammi per microlitro del plasmide helper.

Precipitare il DNA aggiungendo 0,1 volumi di acetato di sodio a 3 molari, in 2,5 volumi di etanolo al 100% ghiacciato. Poi, il vortice. Un precipitato bianco dovrebbe essere immediatamente visibile. Lavare il pellet e risospenderlo nel tampone di iniezione, fino a raggiungere una concentrazione finale totale di 500 nanogrammi per microlitro. Quindi, preparare aliquote da 10 a 15 microlitri ciascuna e conservarle a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius.

Nutrire con sangue le zanzare di età compresa tra 4 e 7 giorni dalla linea di attracco desiderata e le loro controparti di tipo selvatico, 72 ore prima della microiniezione. Eseguire microiniezioni di embrioni di Anopheles gambiae, in cloruro di sodio da 25 millimolari, mirando al polo posteriore dell'embrione con un angolo di 45 gradi.

Eseguire microiniezioni di embrioni di Anopheles stephensi, in olio di alocarburi, puntando il polo posteriore con un angolo di 30 gradi. Immediatamente dopo l'iniezione, trasferire le uova in una capsula di Petri riempita con acqua distillata sterile e rimetterle in condizioni di insetti. Al momento della schiusa, trasferire le larve G₀ in un vassoio con acqua distillata salata ogni giorno e allevarle fino alle pupe.