Multiplex fluorimetrico Metodologia di test immunoenzimatico e risoluzione dei problemi

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di rilevare gli anticorpi contro gli agenti infettivi avventizi negli animali da laboratorio. Ciò si ottiene incubando il siero di prova con microsfere rivestite di antigene. Successivamente, il siero viene incubato con un'anti immunoglobulina specie-specifica biotinilata, che rileva eventuali complessi immunitari antigene-anticorpo.

Quindi viene aggiunta una soluzione di forza fluorescente FICO eryn marcata con streptavidina per rilevare eventuali risultati di immunoglobuline biotinilate che mostrano uno stato anticorpale positivo o negativo per agenti comuni nei roditori di laboratorio in base alla fluorescenza multiplex, al punteggio netto del test immunologico, ai valori del campione fluorescente. Il vantaggio principale dell'utilizzo di questa tecnica rispetto al metodo esistente come Eliza, è che l'MFIA è un test multiplex. Ciò consente a un ricercatore di esaminare fino a cento saggi diversi in un unico test.

Ebbene, questa tecnica riduce la quantità di regioni di siero e di smaltibili usa e getta utilizzati nei metodi esistenti, aumentando al contempo la quantità di informazioni generate da un singolo test. Beh, abbiamo avuto l'idea di utilizzare questo metodo per la prima volta quando stavamo testando un gran numero di campioni di Siero per più agenti e volevamo ridurre la manodopera e i tempi di analisi. A dimostrare la procedura sarà Donna Cohen, una tecnologa senior del nostro laboratorio Per iniziare, tieni pronti due tamponi necessari per la procedura multiplex, fluorescenza, immunodosaggio o MFIA.

Il primo è un diluente primario, disponibile presso Charles River e contiene agenti bloccanti brevettati per ridurre le interazioni non specifiche per il tampone di lavaggio del saggio. Preparare una soluzione di PBS con 1% BSA pH 7,4 per rimuovere il particolato. Filtrare il tampone attraverso un'unità di chiusura del flacone da 0,2 micron in contenitori etichettati sterili utilizzando il tampone di lavaggio del test.

Preparare due x concentrazioni di specie antis biotinilate, IGG o BAG e strep AVID e FICO erything o SPE, che verranno utilizzate per etichettare i complessi anticorpali antigene formati durante la fase di incubazione del siero di prova per preparare campioni dei seguenti materiali e micropipette e punte monouso assemblate multicanale e monocanale e piastre per microtitolazione a 96 pozzetti a basso legame proteico per la diluizione delle proteine. Dopo aver raccolto i campioni di sangue e isolato il siero, vorticare brevemente il siero prima di diluire i campioni nel diluente primario in una piastra per microtitolazione a 96 pozzetti per garantire un'evacuazione corretta e uniforme del pozzetto, pre-bagnata. Ogni pozzetto della piastra di prova a 96 pozzetti con tampone di lavaggio del saggio aspira lentamente la soluzione durante il saggio.

L'aspirazione dovrebbe richiedere da cinque a 10 secondi per evitare l'aggregazione delle microsfere e la compattazione delle microsfere nella membrana del filtro, entrambe le quali possono rallentare i tempi di lettura alla fine del saggio. Verificare che il drenaggio dei liquidi sia stato interrotto tamponando la parte inferiore della piastra di prova con carta assorbente. È importante tamponare la piastra di prova dopo ogni fase di lavaggio per evitare che fuoriesca dai pozzetti durante l'incubazione.

Per preparare le perline, iniziare facendo vorticare la sospensione delle perline accoppiate al calcio. Quindi sonicali brevemente in un bagno. È fondamentale risospendere correttamente le perline per evitare che si formino gruppi di perline aggregati, che possono comportare tempi di lettura più lunghi.

Quindi, erogare la sospensione stock da 20 x in una soluzione di due perline di lavoro nel diluente primario. Quindi erogare 50 microlitri delle due sospensioni di perle X in ciascun pozzetto del saggio della piastra di prova pre-bagnata. Pipettare 50 microlitri di ciascun siero di prova e di controllo sulla piastra di prova in base a una mappa della piastra predefinita.

Fissare il coperchio al piatto. Coprirlo con un foglio di alluminio e incubare la piastra di prova per 60 minuti su un agitatore orbitale a temperatura ambiente per evitare l'evaporazione delle soluzioni che possono impedire il successo del saggio. Tenere la piastra di prova coperta con il coperchio della piastra durante tutte le fasi di incubazione.

Inoltre, la velocità di agitazione dovrebbe essere maggiore di 400, ma inferiore a 700 giri/min in modo che le perle rimangano in sospensione per consentire agli anticorpi sierici di accedere a tutte le superfici degli antigeni accoppiati. Dopo aver lavato la piastra in incubazioni sequenziali delle perle con BAG e SPE, lavare nuovamente i campioni. Quindi risospendere le perle aggiungendo 125 microlitri di dosaggio, lavare, tamponare e agitare per due minuti per leggere la piastra.

Posizionarlo nel lettore di saggi entro 10 minuti dalla sospensione delle microsfere, le perle passano una alla volta attraverso un rivelatore dove vengono esposte a due laser. Un laser eccita i coloranti interni che identificano il set di colori delle perle e l'altro eccita il colorante reporter FICO erything. L'intensità della fluorescenza FICO per un numero predeterminato di perle viene riportata quando FM FI legge il primo pozzetto per verificare che il pannello di perle selezionato corrisponda al profilo della perlina nei pozzetti di prova.

Se sul display del protocollo sono presenti perline che cadono al di fuori della regione del cordone designata, è stata effettuata una selezione errata del profilo. Le microsfere che sono state correttamente risospese riempiranno le regioni specificate come indicato nel software di lettura del saggio. Se le perline sono aggregate, riempiranno le loro regioni a un ritmo lento.

È possibile rimuovere la piastra di prova dal lettore e risospendere manualmente i pozzetti per separare le perline. Rimuovere la piastra di prova dal lettore e utilizzare un pipettatore multicanale a tre volte ogni pozzetto. Quindi restituire la piastra di prova al lettore e continuare a esaminare i risultati.

Segnalare la presenza di errori come un numero inadeguato di microsfere o la caduta dei punteggi delle microsfere IgG anti IgG e ripetere il test per questi campioni. Dopo aver esportato i dati in Excel e calcolato l'MFI netto, determinare se uno qualsiasi dei controlli del test di riproduzione esclude il siero immunitario ad alta gamma. Eventuali controlli non superati sono inaccettabili e il test deve essere ripetuto.

Questa tabella rappresenta i dati per i controlli del siero di prova e del test da una tipica piastra di analisi. Tutti i controlli IgG sono stati superati. I risultati dei test per questo gioco indicano che numerosi campioni di controllo reattivi ai tessuti e IgG hanno fallito come si è visto nei pozzetti arancioni.

A1C uno e F1 indicano un fallimento reattivo tissutale TC in cui il punteggio TC è rappresentato tra parentesi, i pozzetti B uno ed E uno illustrano i due tipi di fallimenti del controllo interno IgG, anticorpi di test insufficienti o reagenti di test, rispettivamente BAG o SPE. I risultati della piastra di prova vengono interpretati solo se il controllo di idoneità del sistema e il controllo del siero soddisfano i criteri di accettazione qui indicati. Le microsfere rivestite con immunoglobuline sieriche anti-test specie-specifiche possono mostrare punteggi negativi a causa dell'aggiunta di un campione insufficiente troppo alto, di una diluizione del campione, di specie errate o di un siero di test proveniente da un ospite immunodeficiente.

Se i risultati del test play sono soddisfacenti, i punteggi dei singoli test vengono classificati in base a quanto segue. Seguendo questa procedura, dovremmo utilizzare metodi aggiuntivi come Eliza, IFA e/o Western blot per confermare i risultati iniziali inaspettati o positivi. È fondamentale verificare questi risultati prima di prendere qualsiasi decisione sulla gestione degli animali.

Questo può essere fatto utilizzando metodologie diverse sullo stesso campione o su campioni aggiuntivi della stessa colonia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il fluoro multiplex, immunodosaggio metrico e di interpretare i risultati ottenuti presso la tua struttura. Ciò ti consentirà di ridurre la manodopera raccogliendo più informazioni da ciascun campione di test.