Name: Multiplex fluorimetrico Metodologia di test immunoenzimatico e risoluzione dei problemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Impara la tecnica MFIA per la sierosorveglianza in animali da laboratorio utilizzando microsfere rivestite con antigeni e rilevazione fluorimetrica. Questo metodo multiplex riduce i tempi e i consumi rispetto agli ELISA tradizionali.

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La ricerca qui presentata è stata sostenuta da Charles River.

<ol><li>MFIA Rodent Methods Manual [Internet]. , Charles River. Available from:
		
	 <a target="_blank" href=" http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA Rodent_Methods_Manual.pdf"> http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA Rodent_Methods_Manual.pdf</a> (2011).</li>
<li>Rodent MFIA Validation Summary Report [Internet]. , Charles River. Available from:
		
	 <a target="_blank" href="http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA _summary_report.pdf">http://www.criver.com/SiteCollectionDocuments/rm_ld_r_MFIA _summary_report.pdf</a> (2007).</li>
<li>Jacobson, R. H., et al. Principles of validation of diagnostic assays for infectious diseases. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJacobson%2C+RH+%22Manual+of+Standards+for+Diagnostic+Tests+and+Vaccines%22">Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines</a>. , Office International des Epizooties (OIE). France. 8-15 (1996).</li>
<li>Wright, P. F. International standards for test methods and reference sera for diagnostic tests for antibody detection. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWright%2C+PF+%22Rev.+sci.+tech.+Off.+int.+Epiz%22">Rev. sci. tech. Off. int. Epiz</a>. 17 (2), Office International des Epizooties (OIE). France. 527-533 (1998).</li>
<li>Pepe, M. S. The Statistical Evaluation of Medical Tests for Classification and Prediction. , Oxford University Press. Oxford, New York. (2003).</li>
<li>Barr, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+and+interpretation+of+diagnostic+tests+for+feline+immunodeficiency+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Vet.+Med.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Comparison and interpretation of diagnostic tests for feline immunodeficiency virus infection.</a> J. Am. Vet. Med. Assoc. 199, 1377-1381 (1991).</li>
</ol>

Tutti i lavori di autori per Charles River RADS, uno dei principali fornitori di servizi di sierologia sperimentazione animale e reagenti.

Il processo di test MFIA è altamente efficiente, richiedono meno materiale e più piccolo del campione e volumi di reagente rispetto ai test tradizionali singleplex. La funzionalità del sistema multiplex dà all&#39;utente la flessibilità di schermo contemporaneamente per più ceppi o sierotipi di agenti comuni in roditori da laboratorio (cioè Coronavirus, parvovirus, ecc). Questo ci consente anche, a progettare pannelli personalizzati tallone sulla base dell&#39;area di interesse (cioè famiglia di virus specifico) ed è adattabile a tipi di screening altre biomolecole quali citochine e altri indicatori biologici. Inoltre, ci permette di incorporare diversi saggi di controllo interno per verificare campione e idoneità sistema e quindi assicurare l&#39;accuratezza dei risultati. Questi includono il controllo di tessuti e IgG anti-immunoglobulina specie di prova del siero (αIg) rivestite insiemi di sferette per valutare l&#39;idoneità del campione. Un tessuto sfera di controllo rileva il legame non specifico di immunoglobulina siero e il controllo αIg tallone confermache il siero è stato aggiunto e contiene una concentrazione sufficiente di immunoglobulina. Un&#39;altra perla di controllo, rivestito con immunoglobuline specie siero, dimostra che i reagenti marcati e lettore di test funzionano correttamente. Altri multiplex disponibili in commercio test sierologici formato (es. microarrays, ImmunoComb) non può offrire lo stesso livello di risultato conferma. La possibilità di ridurre la possibile fonte di fallimento prima della rianalisi dosaggio può aiutare un investigatore risparmiare tempo e materiali. Aspetti critici della MFIA deve essere confermata prima di ripetere un campione fallito. Dal momento che il test è condotto a temperatura ambiente è necessario verificare che la temperatura del laboratorio è di circa 27 ° C ± 2 ° C, temperature più elevate possono portare a una riduzione di punteggi previsti per i controlli ed i campioni. Lavaggio è forse la fase più critica nel saggio. Assicurare che la piastra di prova viene adeguatamente lavati, cancellati e risospese può eliminarela maggior parte degli errori di campionamento dovuti a basso numero di tallone (per perline aggregati) o addizione del reagente insufficiente (perso per wicking su fondo piastra prova filtro). Abbiamo regolarmente contare 25 perline per dosaggio (agente) e hanno trovato alcuna differenza statistica tra i risultati contando più alto numero di perline, che porterà anche ad un tempo più lungo di lettura per la piastra. Abbiamo effettuato studi di convalida complete di MFIA su diverse specie di animali da laboratorio di uso comune (topo, ratto, criceto, cavia e coniglio), per dimostrare l&#39;accuratezza diagnostica, la riproducibilità e robustezza testando un gran numero di noti campioni di sieri positivi e negativi, e confrontando il loro ELISA, IFA e risultati MFIA. I limiti di rilevazione (cioè, standard endpoint immunitarie titolazione del siero) di MFIA erano paragonabili a, e in alcuni casi superato, quelli corrispondenti ELISA. Specificità diagnostica, misurata con roditore sieri SPF, ha superato il 99%, il betwee corrispondenza generalen ELISA e MFIA eseguita noto sieri positivi e negativo noto era superiore al 95%. In sintesi, questi risultati hanno dimostrato che MFIA multiplex è una buona alternativa al singleplex ELISA, ed è adatto per la sua destinazione d&#39;uso, ovvero in sierosorveglianza routine delle colonie di animali da laboratorio.

multiplex fluorimetrico metodologia di test immunoenzimatico e risoluzione dei problemi

Multiplexed Fluorometric ImmunoAssay Testing Methodology and Troubleshooting

Al fine di garantire la qualità dei modelli animali utilizzati nella ricerca biomedica, abbiamo sviluppato una serie di strategie di sperimentazione e dei metodi diagnostici per determinare se gli animali sono stati esposti a accidentali agenti infettivi (virus, micoplasmi, e altri microrganismi esigenti). Infezioni di animali immunocompetenti sono generalmente transitori, ma le risposte anticorpali sierici infezione spesso possono essere rilevate entro giorni o settimane e persistono per tutta la vita dell&#39;ospite. La sierologia è il metodo diagnostico primario attraverso il quale vengono monitorati animali da laboratorio. Storicamente la indiretto enzyme-linked test immunoenzimatico (ELISA) è stato il principale metodo di screening per sierosorveglianza. L&#39;ELISA è eseguita come singleplex, in cui uno microbica reazione antigene-anticorpo è misurato per pozzetto. In confronto la MFIA viene eseguita come saggio multiplex. Dal momento che le microsfere sono in 100 set di colori distinti, fino a 100 diversi test possono essere eseguiti Simultanogni cambio in una micropiastra solo bene. Questa innovazione diminuisce la quantità di siero, reagenti e prodotti monouso necessarie per il test di routine, aumentando la quantità di informazioni ottenute da un singolo test ben. Inoltre, siamo in grado di integrare molteplici sfere di controllo interno per verificare l&#39;idoneità del campione e sistema e quindi garantire l&#39;accuratezza dei risultati. Questi includono il controllo di tessuti e IgG anti-immunoglobulina specie di prova del siero (αIg) rivestite insiemi di sferette per valutare l&#39;idoneità del campione. Come in ELISA e IFA, il controllo di tessuto rileva legame non specifico di immunoglobulina sierica. Il controllo αIg (siero di controllo) conferma che il siero è stato aggiunto e contiene una concentrazione sufficiente di immunoglobuline IgG, mentre la sfera di controllo (idoneità del sistema di controllo), ricoperti di siero di immunoglobuline specie, dimostra che i reagenti marcati e Luminex lettore funzionino correttamente.

Utilizzo di microsfere Luminex Corporation xMAP tecnologia, abbiamo sviluppato il immunoenzimatico Multiplexed fluorimetrico (MFIA) per sierosorveglianza di varie specie di animali da laboratorio. Il MFIA è un microarray sospensione dove antigene, controllo di tessuto o immunoglobuline sono legati covalentemente a microsfere di polistirene codice colore. Il metodo di prova MFIA così come i vari argomenti di risoluzione dei problemi è indirizzata.

Multiplex fluorimetrico Metodologia di test immunoenzimatico e risoluzione dei problemi

Per garantire la qualità dei modelli animali utilizzati nella ricerca biomedica, abbiamo sviluppato diverse strategie e metodi di test diagnostico per determinare se...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è rilevare anticorpi contro agenti infettivi avventizi negli animali da laboratorio. Questo viene ottenuto incubando il siero in esame con microsfere rivestite di antigene. Successivamente, il siero viene incubato con un'immunoglobulina anti-specie specifica marcati con biotina, che rileva eventuali complessi immunitari antigene-anticorpo.Quindi viene aggiunta una soluzione di streptavidina marcata con FICO eryn Fluor force per rilevare eventuali immunoglobuline biotinilate; i risultati ottenuti mostrano lo stato anticorpale positivo o negativo per agenti comuni nei roditori da laboratorio, in base al punteggio netto dell'immunoassay a fluorescenza multiplex, ai valori fluorescenti del campione. Il principale vantaggio dell'utilizzo di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come Eliza è che MFIA è un saggio multiplex. Ciò consente a un ricercatore di analizzare fino a cento diversi saggi in un singolo test.Beh, questa tecnica riduce la quantità di sieri e di materiali monouso smaltiti rispetto ai metodi esistenti, aumentando al contempo la quantità di informazioni ottenute da un singolo test. Inizialmente abbiamo avuto l'idea di utilizzare questo metodo quando stavamo analizzando un elevato numero di campioni di siero per diversi agenti e desideravamo ridurre lo sforzo lavorativo e il tempo di analisi. A dimostrare la procedura sarà Donna Cohen, tecnologa senior del nostro laboratorio. Per cominciare, preparare due tamponi necessari per la procedura di immunodosaggio fluorescente multiplo o MFIA.Il primo è un diluente primario, disponibile presso Charles River, che contiene agenti bloccanti proprietari per ridurre le interazioni non specifiche nel buffer di lavaggio per il saggio. Preparare una soluzione di PBS con BSA al 1% a pH 7,4 per rimuovere le particelle. Filtrare il buffer attraverso un'unità sterile da bottiglia da 0,2 micron in contenitori sterili etichettati utilizzando il buffer di lavaggio per il saggio.Preparare due concentrazioni x di specie antis biotinilata, IGG o BAG e streptavidina e ficocianina o SPE, che verranno utilizzate per etichettare i complessi antigene-anticorpo formati durante il passaggio di incubazione con siero di prova, per preparare campioni dei seguenti materiali e dispositivi monouso: micropipette multicanale e monocanale con relative punte, e piastre microtitolazione da 96 pozzetti a bassa adesione proteica per la diluizione delle proteine. Dopo aver raccolto i campioni di sangue e isolato il siero, vortexare brevemente il siero prima di diluire i campioni nel diluente primario in una piastra microtitolazione da 96 pozzetti per garantire un'adeguata e uniforme evacuazione dei pozzetti; prerisciacquare ogni pozzetto della piastra da 96 pozzetti con tampone di lavaggio per saggio, quindi aspirare lentamente la soluzione durante tutto il saggio.L'aspirazione deve richiedere da cinque a dieci secondi per evitare l'aggregazione delle microsfere e il loro compattamento nella membrana filtrante, entrambi i fenomeni possono rallentare i tempi di lettura al termine del saggio. Verificare che lo scarico del liquido si sia arrestato tamponando la parte inferiore della piastra di prova con tovaglioli di carta. È importante tamponare la piastra di prova dopo ogni passaggio di lavaggio per prevenire il fenomeno di risalita del liquido dai pozzetti durante l'incubazione.Per preparare le perle, iniziare agitando la sospensione di perle coniugate in stock mediante vortex. Successivamente, sottoporle brevemente a sonificazione in bagno. È fondamentale risospendere correttamente le perle per evitare la formazione di aggregati, che potrebbero causare tempi di lettura più lunghi.Successivamente, distribuire la sospensione del ceppo 20 x in una soluzione di perle a concentrazione lavorativa 2 x nel diluente primario. Quindi distribuire 50 microlitri della sospensione di perle 2 x in ciascun pozzetto dell'analisi della piastra di prova pre-umidificata. Pipettare 50 microlitri di ciascun siero di prova e controllo 2 x nella piastra di prova in base a una mappa della piastra predeterminata.Fissare il coperchio alla piastra. Coprirla con della carta d'alluminio e incubare la piastra di prova per 60 minuti su un agitatore orbitale a temperatura ambiente per evitare l'evaporazione delle soluzioni, che potrebbe compromettere il successo del saggio. Mantenere la piastra di prova coperta con il coperchio della piastra durante tutti i passaggi di incubazione.Inoltre, l'agitazione deve avvenire a una velocità superiore a 400 ma inferiore a 700 giri al minuto, in modo che le microsfere rimangano in sospensione, permettendo agli anticorpi sierici di accedere a tutte le superfici degli antigeni legati. Dopo aver lavato la piastra mediante incubazioni sequenziali delle microsfere con BAG e SPE, lavare nuovamente i campioni. Successivamente, risospendere le microsfere aggiungendo 125 microlitri di tampone di lavaggio per il saggio e agitare per due minuti prima di leggere la piastra.Posizionarlo nel lettore del saggio entro 10 minuti dalla risospensione delle microsfere; le microsfere passano una alla volta attraverso un rilevatore in cui vengono esposte a due laser. Un laser eccita i coloranti interni che identificano il set cromatico delle microsfere e l'altro eccita il colorante reporter FICO erything. L'intensità della fluorescenza FICO erything per un numero predeterminato di microsfere viene riportata come valore FM FI; leggere il primo pozzetto per verificare che il pannello di microsfere selezionato corrisponda al profilo delle microsfere nei pozzetti del test.Se ci sono perle che cadono al di fuori della loro regione designata nel display del protocollo, &egrave; stata effettuata una selezione del profilo errata. Le perle che sono state correttamente risospese riempiranno le loro regioni specificate come indicato nel software del lettore per saggi. Se le perle sono aggregate, riempiranno le loro regioni a un ritmo lento.È possibile rimuovere la piastra di prova dal lettore e risospendere manualmente i pozzetti per separare le perle. Rimuovere la piastra di prova dal lettore e, utilizzando una pipetta multicanale, aspirare e dispensare ogni pozzetto da tre a quattro volte. Quindi reinserire la piastra di prova nel lettore e continuare a esaminare i risultati.Segnalare eventuali errori, come conteggi inadeguati di perle o punteggi delle perle IgG anti IgG inferiori alla soglia, e ripetere il saggio per questi campioni. Dopo aver esportato i dati in Excel e calcolato il MFI netto, determinare se uno dei controlli del saggio di prova risulti fuori dai limiti, escludendo il siero immune ad alto range. Eventuali controlli non validi sono inaccettabili e il saggio deve essere ripetuto.Questa tabella rappresenta i dati relativi al siero in prova e ai controlli del saggio provenienti da una piastra tipica. Tutti i controlli IgG hanno superato il test. I risultati per questa piastra indicano che numerosi campioni di controllo reattivi ai tessuti e IgG non hanno superato il test, come mostrato nelle pozzette arancioni.A1C uno e F1 indicano un fallimento reattivo del tessuto TC in cui il punteggio TC è riportato tra parentesi; i pozzetti B uno ed E uno illustrano i due tipi di fallimento del controllo interno IgG, rispettivamente anticorpo del test insufficiente o reagenti del test insufficienti, BAG o SPE. I risultati della piastra del test vengono interpretati solo se il controllo di idoneità del sistema e il controllo sierologico soddisfano i criteri di accettazione qui indicati. Le microsfere rivestite con immunoglobuline anti siero del test specifiche per specie possono mostrare punteggi non conformi a causa dell'aggiunta di un campione insufficiente, di una diluizione del campione troppo elevata, di una specie errata o del siero prelevato da un ospite immunodeficiente.Se i risultati del controllo del saggio sul gioco di prova sono soddisfacenti, i punteggi individuali del saggio vengono classificati secondo quanto segue. Seguendo questa procedura, dovremmo utilizzare metodi aggiuntivi come Eliza, IFA e/o Western blot per confermare i risultati iniziali inattesi o positivi. È fondamentale verificare questi risultati prima di prendere qualsiasi decisione relativa alla gestione degli animali.Questo può essere eseguito utilizzando diverse metodologie sullo stesso campione o su campioni aggiuntivi provenienti dalla stessa colonia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il saggio immunoanalitico multiplex con marcatura fluorescente e di come interpretare i risultati ottenuti presso la tua struttura. Ciò ti permetterà di ridurre la manodopera pur raccogliendo maggiori informazioni da ciascun pozzetto del campione in esame.

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