Rilevazione quantitativa multiplexata di batteri mediante microsfere magnetiche marcate con colorante

Prelevare una piastra di analisi contenente una miscela di microsfere di polistirene magnetico tinte internamente con fluorofori spettralmente diversi.

Ogni set di microsfere è accoppiato in modo covalente a distinti anticorpi di cattura specifici per batteri patogeni.

Aggiungere una miscela batterica patogena uccisa dal calore. Incubare.

Gli anticorpi di cattura legano gli antigeni batterici bersaglio, formando complessi microsfera-batteri.

Utilizzare un separatore magnetico per depositare i complessi. Eliminare i batteri non legati e lavare con il tampone.

Aggiungere tampone e anticorpi di rilevamento biotinilati, che si legano specificamente ai batteri legati alle microsfere.

Separare magneticamente i complessi e lavare con tampone.

Risospendere i complessi nel buffer. Pipettare molecole reporter comprendenti streptavidina accoppiata a fluoroforo, che si legano agli anticorpi di rilevamento biotinilati.

Separare e lavare magneticamente i complessi. Risospensione nel buffer.

Durante l'analisi basata sul flusso, il primo laser eccita i fluorofori interni della microsfera, generando firme spettrali uniche e identificando set di microsfere unici.

Il secondo laser eccita i reporter fluorofori legati ai batteri su microsfere, quantificando i batteri su vari set di microsfere, consentendo il rilevamento quantitativo multiplex dei batteri.

Per la cattura del campione, iniziare aggiungendo cinquanta microlitri di microsfere, o perle coniugate per catturare gli anticorpi in una piastra a 96 pozzetti. Quindi, aggiungere cinquanta microlitri di batteri patogeni seguiti da cinquanta microlitri di PBS-TBN nei pozzetti di fondo.

Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare su un agitatore per piastre a ottocento giri/min per un'ora.

Successivamente, posizionare la piastra sul separatore magnetico per 1 minuto per separare le perline. Evacuare la soluzione rimanente, mantenendo la piastra sul separatore magnetico a piastra. Quindi, picchiettare per asciugare su carta assorbente da laboratorio tre o quattro volte. Lavare accuratamente i pozzetti con PBS-TBN due volte.

Per la rilevazione del campione, aggiungere nei pozzetti cinquanta microlitri di tampone di analisi seguiti da cinquanta microlitri di anticorpo di rilevazione biotinilato a una concentrazione di quattro microgrammi per millilitro.

Incubare la piastra al buio per un'ora per consentire un'interazione efficiente tra i batteri e gli anticorpi di rilevamento. Successivamente, separare le perle utilizzando il separatore magnetico e lavare le perle con PBS-TBN, come dimostrato in precedenza.

Risospendere le perle in cinquanta microlitri di tampone di saggio e aggiungere cinquanta microlitri di streptavidina-R-ficoeritrina o SAPE, una molecola reporter fluorescente. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare sull'agitatore per piastre per 30 minuti.

Una volta lavati i pozzetti, risospendere le perle in 100 microlitri di PBS-TBN e caricare la piastra sull'analizzatore a flusso.

Registrare le letture utilizzando un software appropriato. I valori mediani netti di intensità della fluorescenza per ciascun organismo possono essere valutati attraverso una curva standard per determinare la carica batterica presente nel campione.