Amplificazione isotermica multiplex basato su piattaforma diagnostica per rilevare Zika, Chikungunya e Dengue 1

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare l'uso di una piattaforma diagnostica point-of-care multiplexata che non richiede un'ampia preparazione del campione e una strumentazione costosa e viene utilizzata in una varietà di campioni biologici. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della diagnostica point-of-care, come il rilevamento di diversi bersagli in una singola provetta di reazione. Utilizzando l'amplificazione isotermica mediata da loop accoppiata a sonde di spostamento del filamento specifiche per il bersaglio, è possibile rilevare in modo efficiente tre diversi virus.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che utilizza l'amplificazione isotermica invece della PCR e richiede una preparazione minima del campione e può essere applicata a una vasta gamma di campioni clinici. Inizia tagliando i fogli di carta Q in piccoli rettangoli di tre millimetri per quattro millimetri usando un perforatore per carta. Quindi usa un micro pestello per schiacciare le zanzare femmine di Aedes aegypti potenzialmente infette da Zika su ogni carta.

Pipettare 20 microlitri di una soluzione acquosa di ammoniaca molare su ogni pezzo di carta. Dopo cinque minuti, lavare ogni carta con 20 microlitri di etanolo al 50%, seguiti da 20 microlitri di acqua priva di nucleasi. Asciugare la carta all'aria in una cabina di biosicurezza BSL-2 per circa un'ora.

Dopo l'essiccazione, utilizzare una pinzetta per immergere completamente ogni carta in 100 microlitri di miscela di reazione RT-LAMP e incubare a 65-68 gradi Celsius per 45 minuti. Leggi e registra la fluorescenza derivante dal virus Zika utilizzando una scatola di osservazione stampata in 3D con una sorgente luminosa a LED e un filtro arancione o giallo. Iniziare aggiungendo 90 microlitri di tampone di reidratazione 1,1 volte a ciascuna provetta di reazione contenente reagenti RT-LAMP liofilizzati e sciogliere agitando.

Quindi gira brevemente verso il basso a 1.000 volte la gravità. Dopo la centrifugazione, aggiungere 10 microlitri di campione di urina addizionato con l'RNA virale alle provette di reazione e mescolare pipettando. Se si testano le zanzare, aggiungere un rettangolo di carta Q che contiene le carcasse di zanzara insieme a 10 microlitri di acqua purificata al posto dell'urina.

Posizionare le provette chiuse in un blocco termico preimpostato a 65-68 gradi Celsius e incubare per 30-45 minuti. Dopo l'incubazione, tenere le provette chiuse per evitare la contaminazione di saggi futuri e riporle nella scatola di osservazione. Accendere l'interruttore sul retro della scatola di osservazione.

Osservare il campione attraverso il filtro arancione e catturare l'immagine con la fotocamera di un cellulare che viene tenuta a una distanza tale da riempire l'80% del campo visivo. Al termine della visualizzazione, spegnere l'interruttore. Conservare le provette sigillate al buio, preferibilmente in frigorifero, se è necessaria una visualizzazione successiva.

Sia nei casi singleplex che in quelli multiplex, i prodotti RT-LAMP appaiono come una lettera di concatemers quando vengono eseguiti su gel di agarosio. I campioni di controllo negativo contenenti acqua come campione hanno fornito solo le bande per i primer stessi, incluso il controllo target non specifico in cui l'acido nucleico totale estratto da una zanzara femmina non infetta è stato utilizzato come modello. La fluorescenza verde è osservata per Zika utilizzando sonde come cinque NT prime marcate con FAM.

La fluorescenza giallo verde chiaro è assegnata a Chikungunya dove la sonda è composta da cinque NT primari marcati con HEX. Una fluorescenza rosso arancio viene utilizzata per la Dengue-1, dove la sua sonda è composta da cinque NT primari marcati con TAMRA. Due cartine contenenti zanzare sono state immerse direttamente nella miscela RT-LAMP e dopo l'incubazione a 65 gradi Celsius per 30 minuti, è stata osservata una fluorescenza verde brillante in presenza del virus Zika.

Utilizzando nove volumi di tampone di reidratazione e un volume di campione di urina, la fluorescenza verde visibile può essere generata entro 30 minuti e l'immagine può essere catturata da qualsiasi fotocamera del cellulare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della diagnostica clinica per esplorare piattaforme point-of-care per rilevare i virus trasmessi dalle zanzare nelle urine, nel sangue, nella saliva o nelle carcasse di zanzara. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare un sistema di amplificazione isotermica, in questo caso si tratta di una lampada, per rilevare Zika e altri arbovirus in modo multiplex in una varietà di campioni biologici.