Saggio Immunobead Multianalita: una tecnica di immunodosaggio basata sul flusso per la rilevazione concomitante di più sottotipi di anticorpi in un campione di siero umano

Il test delle immunosfere multianalita utilizza più microsfere rivestite di antigene per riconoscere contemporaneamente gli anticorpi bersaglio corrispondenti.

Per iniziare questo test, prelevare una miscela di microsfere in una provetta contenente il tampone appropriato. Ogni perlina è rivestita con un antigene specifico sulla sua superficie, consentendo una facile differenziazione delle perle l'una dall'altra.

Pipettare la miscela di immunosfere rivestita nei pozzetti di una piastra per il saggio per microtitolazione. Integrare i pozzetti con il campione di siero contenente diversi isotipi di anticorpi bersaglio. Queste varianti hanno sottili differenze nelle loro strutture, consentendo a ciascun pozzetto di avere più anticorpi primari.

Incubare, per consentire agli isotipi anticorpali del campione di legarsi ad antigeni specifici catturati sulle rispettive immunosfere. Lavare con un tampone di saggio per rimuovere gli anticorpi primari non legati. Aggiungere nel pozzetto anticorpi secondari marcati con colorante fluorescente, corrispondenti a ciascuna variante di anticorpo primario.

Ogni anticorpo secondario marcato si lega al sito Fc del rispettivo anticorpo primario. Più complessi antigene-anticorpo primario catturati da microsfere sono marcati in fluorescenza. Lavare la piastra per rimuovere gli anticorpi secondari non legati.

Leggere la piastra utilizzando un analizzatore fluorescente in grado di rilevare contemporaneamente diversi fluorofori alle rispettive lunghezze d'onda. A seconda del rilevamento del segnale, è possibile valutare vari isotipi di anticorpi sierici e il loro legame a diversi antigeni.

Per ottenere prestazioni di analisi, risospendere le microsfere accoppiate mediante vortice per 30 secondi e sonicare per 60-90 secondi. Quindi, rimuovere la quantità richiesta di ciascun colloide di perle dalla rispettiva provetta e combinare i colloidi di perle in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millimetri.

Quindi, inserire il tubo in un separatore magnetico e lasciare la separazione per 60 secondi. Con il tubo ancora nel separatore magnetico, rimuovere il surnatante, senza disturbare il pellet di perline.

Dopo aver rimosso le microsfere dal separatore, risospendere le microsfere in 100 microlitri di tampone di saggio. Agitare per 30 secondi prima di inserire il tubo in un separatore magnetico per 60 secondi, per separare le perline. Ripetere il lavaggio due volte.

Successivamente, regolare la concentrazione della miscela di microsfere di lavoro a tre plessi aggiungendo un volume appropriato di tampone di saggio per generare una concentrazione finale di 100 microsfere per 1 μl, per ciascun target.

Aliquotare 25 microlitri della miscela di microsfere in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Diluire i campioni di plasma o siero 500 volte nel tampone di saggio e preparare i campioni standard in base alla titolazione desiderata.

Aggiungere 25 microlitri di tampone di saggio come campione bianco e aggiungere ciascuno dei campioni diluiti o standard in ciascun pozzetto designato di una piastra di 96 pozzetti. Al termine, coprire la piastra con un sigillo di alluminio o un foglio di alluminio per incubare per 1 ora a temperatura ambiente su uno shaker per piastre impostato a 700 rotazioni al minuto.

Preparare una soluzione di anticorpi anti-rilevamento umano, o soluzioni di anticorpi secondari, a 4 μg/mL con tampone di saggio, come descritto nel manoscritto. Posizionare la piastra su un separatore magnetico per lavarla rapidamente, quindi capovolgere con forza la piastra su un contenitore a rischio biologico per rimuovere il liquido dai pozzetti. Con la piastra ancora capovolta, picchiettare con forza la piastra contro un batuffolo di carta spessa.

Quindi, lavare ogni pozzetto con 100 microlitri di tampone per saggio e rimuovere il liquido mediante inversione forzata su un contenitore a rischio biologico. Ripetere il lavaggio due volte. Dopo l'ultimo lavaggio, gettare tutti i batuffoli di carta usati in un contenitore a rischio biologico.

Quindi, aggiungere 25 microlitri di soluzione di lavoro per anticorpi secondari a ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti e coprire la piastra con un foglio di alluminio per incubare su un agitatore per piastre a 700 rotazioni al minuto.

Dopo 30 minuti di incubazione, lavare due volte i pozzetti della piastra con un tampone di saggio, come dimostrato in precedenza. Quindi, aggiungere 100 microlitri di tampone di analisi in ciascun pozzetto della piastra a 96 pozzetti. Coprire la piastra con un foglio di alluminio e incubare per cinque minuti su uno shaker a temperatura ambiente.

Analizzare un campione da 60 microlitri tramite l'analizzatore dello strumento secondo il manuale del sistema.