Name: Isolamento primario Microglia misti da colture cellulari gliali del tessuto neonatale cervello di ratto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-15T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Impara l'isolamento primario di microglia da cervelli neonatali di ratto mediante colture gliali miste e agitazione meccanica. Questo protocollo fornisce cellule ad alta purezza per studi in vitro sulle funzioni microgliali.

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Finanziato dal programma intramurale presso l&#39;Università Uniformed Services.

1. La dissezione del tessuto neonatale cervello di ratto <ol><li> Freddo Leibovitz L-15 mezzi condizionati (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) a 4 ° C. Terreni di coltura caldi (DMEM + 10% FBS + 1% di penicillina / streptomicina) a 37 ° C. Preparare 4 60x15 mm piastre Petri con 4-5 ml del condizionato L-15 supporti su ghiaccio. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici con il 100% di etanolo. </li><li> Sciacquare i cuccioli P2 rap neonatali con il 70% di etanolo. (Cuccioli di ratto neonato di età compresa tra P1-P5 può essere utilizzato in questo protocollo.) </li><li> Rapidamente decapitare un topo cucciolo con sterili forbici affilate e rilasciare la testa immediatamente in etanolo al 70%. Ripetere l&#39;operazione per un totale di 5 cuccioli di ratto poi trasferire teste in soluzione salina. </li><li> Rimuovere i cervelli interi dalle teste e posto in una capsula di Petri con 4 - 5 ml di soluzione L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep) su ghiaccio. </li><li> Ripetere le procedure di 1,2 - 1,4 per le restanti cuccioli nella cucciolata. </li><li> Rimuovere le meningi dal cervello e trasferire il destessuto cerebrale IRED (cioè, corteccia, cervelletto, cervello intero, ecc) in una capsula Petri nuovo con 4-5 ml di soluzione di L-15 (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA 1% + Pen / Strep) su ghiaccio. </li></ol> 2. Preparazione mista popolazione di cellule gliali <ol><li> Senza danneggiare il tessuto cerebrale con le forbici o una lama, trasferire il tessuto con una pipetta 10 ml ad una sterile tubo da 50 ml. </li><li> Centrifugare conico a 2.500 RCF per 5 min a 4 ° C. </li><li> Aspirare il surnatante. Aggiungere 4-5 ml di fresche L-15 media (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA + 1% Pen / Strep). </li><li> Pipettare il tessuto su e giù per 10 volte con una pipetta sterile 10 ml. </li><li> Mettere un filtro cella (100 pori micron) su un nuovo tubo da 50 ml. Pipettare tessuto su e giù una volta con un ml pipetta sterile 5 e con la pipetta a filo del filtro cella, erogare il materiale attraverso il filtro cella nel tubo conico. </li><li> Sciacquare il filtro cella con 4-5 ml di fresche L-15 media (Leibowitz L-15 + 0,1% BSA Pen + 1% / Strep). </li><li> Centrifuga conica con cellule tese a 2.500 RCF per 5 min a 4 ° C. </li></ol> 3. Placcatura e manutenzione di culture miste cellule gliali <ol><li> Per ciascun cervello di ratto cucciolo trasformati, preparare 1 T-75 sterili pallone aggiungendo 12 ml di coltura supporti (DMEM + 10% FBS + 1% di penicillina / streptomicina) in ciascuna beuta. </li><li> Aspirare il supernatante dalle cellule pellettate e aggiungere 5-6 ml di terreni di coltura per il pellet cellulare. Pipettare su e giù per 10 volte con una pipetta 10 ml. </li><li> Trasferire un ugual volume di sospensione cellulare per ogni T-75 pallone. </li><li> Incubare matracci in 5% CO 2 incubatore a 37 ° C per un totale di 1-3 settimane. </li><li> Cilindri devono essere prima incubate per 5 giorni, e il quinto giorno, sostituire i terreni di coltura in ciascun pallone con 12 ml di mezzo fresco e tornare alla incubatrice. Poi, ogni 3 giorni, sostituire i mezzi condizionati in ogni pallone con 12 ml di mezzi freschi per ottenere confluenza. Questo deve essere farene molto attentamente senza toccare il fondo dei cilindri in cui le cellule si attaccano. </li></ol> 4. Isolamento e placcatura di primaria Microglia <ol><li> Dopo misti culture gliali sono completamente confluenti, rimuovere fiaschi dall&#39;incubatore e coprire i tappi pallone con parafilm per evitare lo scambio di gas con l&#39;aria dell&#39;ambiente. </li><li> Agitare palloni a 100 rps (Companion Lab SI-600, Jeio Tech) per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Raccogliere i media da tutti i palloni con una pipetta 10 ml senza interrompere lo strato di astrociti sulla superficie pallone. Posizionare il supporto in provette da 50 ml. Aggiungi mezzi freschi ai fiaschi e fiaschi di ritorno alla incubatrice. </li><li> Centrifugare tubi conici a 2.500 RCF per 5 minuti a 4 ° C. </li><li> Aspirare il surnatante da tutte le provette coniche. Pellets cellulari sono alte cellule microglia purezza. Pellet risospendere in 1 ml di placcatura mezzi microglia (FES DMEM + 10% + 1% di penicillina / streptomicina). </li><li> Conta la densità delle cellule nei media risospeso utilizzandoun emocitometro. </li><li> Aggiungere un volume appropriato di terreni in piastra microglia per ottenere un 2 x 10E5 cellule per densità di ml. Piastra come appropriato per l&#39;analisi sperimentale. </li><li> Lasciare microglia di allegare tutta la notte. </li></ol> 5. Risultati rappresentativi Il protocollo descritto sopra i risultati in alte culture microglia purezza primarie. Come stabilito dal immunoistochimica per un macrofago / microglia marcatore della cella specifico (Iba1), placcati culture microglia sono&gt; 90% (Figura 2). Inoltre, per la colorazione marcatori cellulari astrociti, oligodendrociti e neuroni specifici dimostra la contaminazione minima (Figura 2). Dopo aver stabilito miste colture di cellule gliali, microglia può essere isolato agitando fino a 4 volte successive. L&#39;isolamento iniziale microglia produrrà circa 2,2 x 106 cellule / ml o circa 9 milioni di cellule per 10 palloni e il rendimento atteso diminuisce con ogni sha successiveke. Microglia isolato da questo metodo sono stati utilizzati con successo per indagare la capacità fagocitosi, funzione come la produzione di ossido nitrico, e la tossicità neuronale (Figura 3) 13-14. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig1.jpg" /> Figura 1. Panoramica del protocollo per la preparazione di colture miste di cellule gliali e l&#39;isolamento della microglia primaria. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig2.jpg" /> Figura 2. Isolamento della microglia elevata purezza, come accertato mediante analisi immunoistochimica utilizzando microglia (Iba-1, rosso), astrociti (GFAP, verde), neurone (NeuN, rosso) e degli oligodendrociti (CC1, rosso) specifici marcatori. Colorazione per il DNA delle cellule in coltura di DAPI (blu) viene anche mostrato. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3814/3814fig3.jpg" /> Figura 3. Microglia isolato nel metodo descriletto sono stati utilizzati in un certo numero di saggi, inclusi, ma non limitati a, saggi fagocitosi, saggi funzionali e studi di neurotossicità. In questi studi, abbiamo trovato che la microglia (Iba-1 positivo, verde), quando esposto a controllare (A) o LPS (B) supporti trattati, aumentare la fagocitosi di fluorescente perle di lattice (rosso), che possono essere quantificati ( C). Inoltre, LPS (1ng/ml) trattamento può aumentare la produzione di ossido nitrico in microglia (D). Infine, via sia Transwell insert-separati o diretti microglia-neuroni culture, abbiamo trovato che la microglia incubate con LPS possono indurre la morte delle cellule neuronali come misurato dalla lattato deidrogenasi (LDH) release (E, F).

<ol><li>Ransohoff, R. M., Perry, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+physiology%3A+unique+stimuli%2C+specialized+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses.</a> Annu. Rev. Immunol. 27, 119-145 (2009).</li>
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<li>Loane, D. J., Stoica, B. A., Pajoohesh-Ganji, A., Byrnes, K. R., Faden, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+metabotropic+glutamate+receptor+5+modulates+microglial+reactivity+and+neurotoxicity+by+inhibiting+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of metabotropic glutamate receptor 5 modulates microglial reactivity and neurotoxicity by inhibiting NADPH oxidase.</a> J. Biol. Chem. 284, 15629-15639 (2009).</li>
</ol>

Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Mentre questo protocollo viene normalmente utilizzato per produrre microglia puro e sano per esperimenti di ricerca, un attento esame degli aspetti tecnici durante parti critiche della procedura minimizzare la variabilità nel microglia isolato. In primo luogo, durante la dissezione di tessuto cerebrale di ratti neonati, lavorando in modo tempestivo è necessario minimizzare il danno ipossico ischemico e al tessuto. Tuttavia, è anche importante per rimuovere completamente il rivestimento meningeo dal cervello durante la d...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nome del reattivo </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td><td> Comments </td></tr><tr><td> 60 mm x 15 mm Scatole Petri </td><td> Fisher marchio </td><td> 0875713A </td><td></td></tr><tr><td> Sharp Forbici per dissezione </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 14094-11 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 7b pinze standard suggerimenti, curvi, 11cm </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 11270-20 </td><td></td></tr><tr><td> Dumont # 5 pinze standard suggerimenti, dritte, 11 cm </td><td> Strumenti di Scienze Belle </td><td> 11251-10 </td><td></td></tr><tr><td> Provette da 50 ml coniche </td><td> VWR </td><td> 89039-656 </td><td></td></tr><tr><td> 5 ml pipette sierologiche </td><td> Grenier Bio One </td><td> 606180 </td><td></td></tr><tr><td> 10 ml pipette sierologiche </td><td> Grenier Bio One </td><td> 607180 </td><td></td></tr><tr><td> 100 um sterile nylon filtro cella </td><td> Falco </td><td> 35-2360 </td><td></td></tr><tr><td> 75 cm 2 di coltura di tessuto fiasche </td><td> Corning </td><td> 430641 </td><td></td></tr><tr><td> Mezzo essenziale minimo di Dulbecco (DMEM) </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 31053-028 </td><td></td></tr><tr><td> Leibovitz L-15 </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 11415064 </td><td></td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 16000-036 </td><td></td></tr><tr><td> Fetale siero equino </td><td> Pescatore </td><td> SH3007402 </td><td></td></tr><tr><td> Penicillina-Streptomicina </td><td> Gibco (Invitrogen) </td><td> 15140163 </td><td></td></tr><tr><td> 100% etanolo </td><td> La Graham Warner Società </td><td> 64-17-5 </td><td></td></tr><tr><td> Soluzione tampone fosfato, 10X, pH 7.4 </td><td> Qualità biologica, inc. </td><td> 119-069-131 </td><td> 1X in sterile, acqua distillata </td></tr><tr><td> Sacchetti di Biohazard </td><td> VWR </td><td> 14220-028 </td><td></td></tr><tr><td> Emocitometro </td><td> Hausser Scientific </td><td> 1492 </td><td></td></tr><tr><td> 6 e piastre di coltura cellulare con superficie Cellbind </td><td> Corning </td><td> 3335 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento primario microglia misti da colture cellulari gliali del tessuto neonatale cervello di ratto

Primary Microglia Isolation from Mixed Glial Cell Cultures of Neonatal Rat Brain Tissue

Conto Microglia per circa il 12% della popolazione cellulare totale nel cervello dei mammiferi. Mentre i neuroni e astrociti sono considerati i principali tipi di cellule del sistema nervoso, microglia svolgere un ruolo importante nella fisiologia normale del cervello attraverso il monitoraggio del tessuto per detriti e agenti patogeni e di mantenere l&#39;omeostasi nel parenchima via 1,2 attività fagocitaria. Microglia vengono attivati ​​nel corso di una serie di condizioni di pregiudizio e malattia, tra cui le malattie neurodegenerative, lesioni cerebrali traumatiche, e l&#39;infezione del sistema nervoso 3. In queste condizioni attivanti, microglia aumentare la loro attività fagocitaria, subire una modifica morpohological e proliferativi, e attivamente secernono le specie reattive dell&#39;ossigeno e dell&#39;azoto, pro-infiammatorie chemochine e citochine, spesso l&#39;attivazione di un loop paracrino o autocrino 4-6. Come queste risposte microgliali contribuire alla patogenesi della malattia in condizioni neurologiche, ricerca incentrata sulla microglia è garantito. A causa della eterogeneità cellulare del cervello, è tecnicamente difficile ottenere sufficiente materiale microglia campione con elevata purezza Durante gli esperimenti in vivo. La ricerca attuale sulle funzioni neuroprotettive e neurotossici di microglia richiedono un metodo di routine tecnica per generare costantemente microglia puro e sano con rendimento sufficiente per lo studio. Presentiamo, nel testo e video, un protocollo per isolare puro microglia primaria da colture miste glia per una varietà di applicazioni a valle. In breve, questa tecnica utilizza il tessuto cerebrale dissociata da ratti neonati per la produzione di colture miste di cellule gliali. Dopo le colture miste gliali raggiungano la confluenza, microglia primari sono meccanicamente isolato dalla coltura mediante una durata breve agitazione. Le microglia vengono quindi piastrate ad elevata purezza per studio sperimentale. Il principio e il protocollo di questa metodologia sono statidescritto in letteratura 7,8. Inoltre, le metodologie alternative per isolare microglia primaria sono ben descritte 9-12. Tessuto cerebrale omogeneizzati possono essere separate mediante centrifugazione in gradiente di densità a cedere primaria microglia 12. Tuttavia, la centrifugazione è di lunghezza moderata (45 min) e può causare danni cellulari e attivazione, così come, causano arricchito microglia e altre popolazioni cellulari. Un altro protocollo è stato utilizzato per isolare microglia primaria in una varietà di organismi da prolungato (16 ore) agitando mentre nella cultura 9-11. Dopo aver agitato, il surnatante dei media viene centrifugato per isolare microglia. Questo metodo di isolamento più due fasi possono anche turbare la funzione e l&#39;attivazione della microglia. Si utilizzano principalmente il seguente protocollo di isolamento microglia nel nostro laboratorio per una serie di ragioni: (1) primaria microglia simulare in biologia vivo più fedelmente rispetto alle linee di cellule microglia immortalati roditori, (2) Rottura nominale meccanica minimizza potenziale disfunzione cellulare o l&#39;attivazione, e (3) resa sufficiente può essere ottenuta senza passaggio delle colture miste di cellule gliali. È importante notare che questo protocollo utilizza tessuto cerebrale da ratti neonati per isolare microglia e che utilizzando ratti anziani isolare microglia possono influenzare notevolmente la resa, stato di attivazione, e le proprietà funzionali della microglia isolato. Ci sono prove che l&#39;invecchiamento è collegato con disfunzione microglia, neuroinfiammazione aumentata e patologie neurodegenerative, studi precedenti hanno quindi utilizzati ex vivo adulti microglia per comprendere meglio il ruolo della microglia nelle malattie neurodegenerative in cui l&#39;invecchiamento è importante parametro. Tuttavia, ex vivo microglia non possono essere mantenute in coltura per periodi di tempo prolungati. Pertanto, mentre questo protocollo prolunga la vita della microglia in coltura primaria, va osservato che la microglia comportarsi differently da adulto microglia e studi in vitro deve essere attentamente considerato quando tradotto in un ambiente vivo.

Isolamento microglia primaria dalla eterogeneità cellulare del cervello è essenziale per studiare il loro ruolo sia in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo descrive un isolamento meccanico e mista tecnica di coltura cellulare che fornisce alta resa ed elevata purezza, cellule vitali primarie per microgliali<em&gt; In vitro</em&gt; Studio e applicazioni a valle.

Isolamento primario Microglia misti da colture cellulari gliali del tessuto neonatale cervello di ratto

Le microglia rappresentano circa il 12% della popolazione cellulare totale nel cervello dei mammiferi. Mentre i neuroni e gli astrociti sono considerati i principali...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare colture primarie di cellule microgliali a partire da cervelli di ratti neonati. Questo viene ottenuto innanzitutto isolando il cervello e rimuovendo le meningi. Il secondo passaggio consiste nell'omogeneizzare il cervello e nel seminare la coltura gliale mista in fiaschi T 75.Successivamente, i flaconi vengono incubati per 10-14 giorni fino a quando un monostrato di astrociti ha raggiunto la confluenza. L'ultimo passaggio consiste nell'agitare i flaconi per staccare i microglia che crescono sulla superficie del monostrato di astrociti, ottenendo così una coltura purificata di microglia. Alla fine, microglia primarie ad alta purezza possono essere utilizzate in successivi saggi in vitro di coltura cellulare singola e di co-coltura.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il metodo del gradiente di Perico, è che la perturbazione meccanica nominale minimizza la disfunzione o l'attivazione dei microglia, e i microglia per gli esperimenti possono essere ottenuti per settimane dopo la preparazione iniziale. Dimostrerò questa procedura insieme a Tammy Tero, studentessa laureata nel laboratorio del Dottor Clifton Dau guard. Le colture di microglia ad alta purezza ottenute con questo protocollo possono essere utilizzate in esperimenti in vitro per studiare la funzione dei microglia in condizioni fisiologiche normali, nonché in condizioni patologiche di malattia.La reattività delle microglia ai danni tissutali, così come agli stimoli infiammatori, ha una rilevanza diretta nelle condizioni di lesione neurologica e di malattie neurodegenerative. In generale, le persone alle prime esperienze con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà a causa dell'inesperienza nel rimuovere le meningi dal tessuto cerebrale in modo tempestivo, al fine di ridurre la contaminazione da fibroblasti nelle colture primarie di microglia. Inoltre, è necessario prestare attenzione a non danneggiare il monostato di astrociti durante l'agitazione delle fiale e la manipolazione delle colture di microglia.Per prepararsi alla procedura, raffreddare il mezzo Chi Livi a L 15 a quattro gradi Celsius, preparare piastre di Petri da 60 per 15 millimetri contenenti mezzo L 15 e porle sul ghiaccio. Riscaldare il mezzo di coltura a 37 gradi Celsius ed assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici siano stati sterilizzati. Dopo aver decapitato un ratto neonato da P uno a P cinque con forbici affilate, immergere la testa in etanolo al 70%.Dopo aver prelevato le teste di cinque ratti neonati, trasferire le teste in soluzione salina. Rimuovere l'intero cervello da ciascuna testa praticando con attenzione delle incisioni su entrambi i lati del cranio al di sopra delle orecchie ed estrarre il cervello, collocandolo in una delle capsule di Petri contenente mezzo L 15 posto sul ghiaccio. Una volta che i primi cinque cervelli sono stati trasferiti nel mezzo L 15 sul ghiaccio, si possono processare successivamente altri cinque ratti nello stesso modo, una volta raccolti tutti i cervelli.Rimuovere le meningi afferrando delicatamente un bordo del foglio meningeo con una pinzetta ed estraendolo con attenzione dalla corteccia sottostante. È essenziale rimuovere completamente le meningi e farlo nel minor tempo possibile. Dopo aver rimosso le meningi, trasferire ciascun cervello in una nuova capsula di Petri contenente mezzo L 15 su ghiaccio.Utilizzare una pipetta da 10 millilitri per aspirare il tessuto cerebrale e il mezzo dalla piastra in un tubo conico sterile da 50 millilitri. Quindi centrifugare a 2.500 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, aspirare.Quindi, utilizzare una pipetta sterile da 10 millilitri per trasferire il campione in un nuovo tubo. Sospendere il pellet in quattro-cinque millilitri di mezzo L 15 fresco, quindi aspirare e rilasciare il mezzo e il tessuto su e giù per 10 volte. Successivamente, posizionare un filtro cellulare con pori da 100 micron su un nuovo tubo conico da 50 millilitri.Utilizzare una pipetta sterile da cinque millilitri per aspirare e dispensare più volte la sospensione tissutale, quindi trasferire il materiale attraverso il filtro cellulare nel tubo conico, avendo cura di lavare bene la pipetta nel filtro. Risciacquare il filtro con quattro-cinque millilitri di mezzo L 15 fresco e freddo. Centrifugare quindi a 2.500 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Per ogni cervello di ratto in via di sviluppo processato, preparare una fiala sterile T 75 aggiungendo 12 millilitri di mezzo di coltura preriscaldata in ciascuna fiala. Successivamente, dopo aver aspirato il sopranatante dalle cellule pellettizzate, aggiungere da cinque a sei millilitri di mezzo di coltura al pellet cellulare ed eseguire 10 pipettature su e giù con una pipetta da 10 millilitri. Trasferire quindi un volume uguale di sospensione cellulare in ciascuna fiala T 75.Incubare i flaconi in un'incubatrice con 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per uno a tre settimane, lasciando le cellule indisturbate per i primi cinque giorni successivi alla semina iniziale. Dopo cinque giorni, sostituire il mezzo condizionato in ciascun flacone con 12 millilitri di mezzo fresco per raggiungere la confluenza. Questa operazione deve essere eseguita con grande attenzione senza toccare il fondo del flacone dove le cellule si attaccano.Una volta che le colture miste di cellule gliali hanno raggiunto completa confluenza, rimuovere il flacone dall'incubatore. Coprire i tappi dei flaconi con parafilm per prevenire lo scambio gassoso con l'aria ambiente e posizionare i flaconi in un incubatore agitatore impostato a 100 RPS e 37 gradi Celsius per un'ora. Trascorso il tempo, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per raccogliere il mezzo dai flaconi senza disturbare lo strato di astrociti e trasferirlo in provette coniche da 50 millilitri. Aggiungere mezzo fresco ai flaconi e riposizionarli nell'incubatore.Dopo aver centrifugato i tubi a 2.500 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius, aspirare il soprannatante e risospendere le cellule in un millilitro di mezzo di semina per microglia. Quindi, contare le cellule utilizzando un citometro umano e procedure standard. Una volta determinato il numero di cellule, aggiungere un volume appropriato di mezzo di semina per microglia per ottenere una concentrazione cellulare desiderata.Una concentrazione di due volte 10 alla cinque cellule per millilitro di piastra è appropriata per l'esperimento; reinserire quindi in incubatore. Lasciare attaccare le microglia durante la notte. Le cellule sono state sottoposte a immunomarcatura con un anticorpo specifico per IBA1, un marcatore delle microglia, che appare di colore rosso.È presente una contaminazione minima della coltura con cellule neuronali, come dimostrato da questa immagine al microscopio derivante da una immunomarcatura con un anticorpo specifico per il nuovo marcatore neuronale NA, che appare in rosso. Il vetrino è stato controcolorato con DPI per evidenziare in blu tutti i nuclei cellulari. Questa immagine mostra l'immunomarcatura con GFAP, un marcatore degli astrociti.Gli astrociti appaiono verdi. Qui vediamo un'immagine della coltura di microglia immuno marcata con un anticorpo specifico per CC uno, un marcatore degli oligodendrociti. Gli oligodendrociti appaiono rossi.Questo istogramma mostra i risultati della quantificazione di ogni tipo cellulare. Si può osservare che le colture di microglia seminate sono pure per oltre il 90%. Questa immagine al microscopio a fluorescenza mostra una coltura di microglia sottoposta a immunomarcatura per IBA1.Le aree rosse sono microsfere di lattice marcate con fluorescenza. La coltura di microglia mostrata è stata trattata con un nanogrammo per millilitro di lipopolisaccaride, e si può osservare che le cellule microgliali hanno fagocitato le microsfere di lattice marcate con fluorescenza. Qui, i risultati del saggio di fagocitosi sono mostrati in un istogramma.Un aumento della fagocitosi è osservabile dopo il trattamento con LPS. Questa figura mostra che anche la produzione di ossido nitrico aumenta nelle colture di microglia dopo l'aggiunta di LPS. Infine, sia le colture di neuroni con microglia direttamente a contatto, sia quelle separate mediante inserti transwell, risultano suscettibili a un aumento della morte cellulare dopo incubazione con LPS, come misurato dal rilascio di lattato deidrogenasi. Una volta padroneggiata la prima parte di questa tecnica, fino al travaso in fiaschi T75, l'operazione può essere completata in un'ora e mezza, e l'intera procedura può essere portata a termine entro due settimane.Un altro aspetto da considerare durante l'ottimizzazione di questo protocollo è la determinazione della durata temporale. Le colture miste di cellule gliali devono essere mantenute per un certo periodo prima dell'isolamento dei microglia primari da seminare, una volta stabilitite colture ad alta purezza. Mediante questa procedura, la funzione dei microglia può essere valutata in vitro misurando la produzione di ossido nitrico, il rilascio di citochine e chemochine, oltre all'attività fasica, tutti parametri determinabili e misurabili mediante saggi di laboratorio di routine.Pertanto, con lo sviluppo di questa procedura, i ricercatori nel campo delle neuroscienze hanno la possibilità di esplorare l'attività delle microglia in un ambiente cellulare omogeneo e di indagarne il ruolo in diverse condizioni neurologiche. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare colture primarie di cellule microgliali a partire dai cervelli di ratti neonati. Isolando innanzitutto il cervello e rimuovendo le meningi, quindi omogeneizzando il cervello e seminando in fiaschi, questi ultimi vengono poi incubati per 10-14 giorni fino a quando un monocitolo di astrociti ha raggiunto la confluenza.L'ultimo passaggio consiste nell'agitare i flaconi per staccare i microglia che crescono sulla superficie del monostrato di astrociti, ottenendo così una coltura purificata di microglia.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video mostra un metodo per isolare e coltivare microglia da cervelli di ratto. Comporta la separazione della microglia da altre cellule neuronali e non neuronali utilizzando piastre rivestite con un anticorpo monoclonale specifico per la microglia.

Isolamento e coltura di microglia da cervelli di ratto utilizzando terreni privi di siero

Il video ha dimostrato il metodo di isolamento e coltura delle cellule dal cervello di un topo neonatale. Ha comportato la dissociazione enzimatica e meccanica del cervello, seguita dalla coltura in terreni di crescita privi di fattore di crescita neuronale per ottenere una popolazione gliale mista.

Ottenimento di una coltura di cellule gliali miste da un cervello di topo neonatale

Noi descriviamo i metodi per l'efficiente e rapido isolamento / cultura della microglia praticabile dalla corteccia cerebrale neonatale e midollo spinale adulto. La dissezione e la placcatura di microglia corticale può essere realizzato entro 90 minuti, con la conseguente raccolta microglia in atto ~ 10 giorni dopo la dissezione iniziale.

Coltura Microglia dal Sistema Nervoso Centrale neonatale e adulti

Una chiave per il successo indagini di biologia microglia è la conservazione dei immunofunction microglia ex vivo durante l'isolamento dal tessuto del sistema nervoso centrale. Isolare microglia via rotanti risultati si stringono in colture cellulari altamente puri e immunofunctional come valutato da immagini fluorescenti, immunocitochimica, ed ELISA dopo l'attivazione della microglia con il lipopolisaccaride stimoli pro-infiammatori (LPS) e Pam 3 CSK 4 (Pam).

Isolamento della corticale Microglia con Immunofenotipo conservato e funzionalità dal murini neonati

Qui, vi presentiamo un protocollo per isolare microglia da cuccioli di topo postnatale (giorno 1) per la sperimentazione in vitro. Questo metodo improvvisato di isolamento genera sia elevata resa e purezza, un vantaggio significativo rispetto ai metodi alternativi che consente un'ampia gamma sperimentazione ai fini di chiarire biologia microglia.

Rapid e raffinato CD11b isolamento magnetico di primaria microglia con purezza migliorata e versatilità

Sforzi per comprendere la funzione di microglial in dettaglio sono stati ostacolati dalla mancanza di modelli di cultura microglial che ricapitolano le proprietà di microglia maturo in vivo . Questo protocollo descrive un metodo di isolamento e coltura progettato per mantenere la sopravvivenza robusto di ratto maturo altamente ramificato microglia in condizioni definite e medie.

Isolamento e coltura di Microglia roditore per promuovere una dinamica ramificate morfologia in Medium senza siero

Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento in vitro di più popolazioni di cellule gliali da un SNC di topo. Questo metodo consente la segregazione delle microglia regionali, delle cellule precursori degli oligodendrociti e degli astrociti per studiare i fenotipi di ciascuno in una varietà di sistemi di coltura.

Dissezione e isolamento della glia murina da più regioni del sistema nervoso centrale

Questo protocollo è un metodo efficiente, conveniente e robusto per isolare la microglia primaria dal tessuto cerebrale umano vivo, adulto. Microglia umana primaria isolata può servire come strumento per studiare i processi cellulari in omeostasi e malattia.

Ottenere Microglia Umana da Tessuto Cerebrale Umano Adulto

Le colture primarie di microglia sono comunemente utilizzate per valutare nuove molecole anti-infiammatorie. Il presente protocollo descrive un metodo riproducibile e rilevante per isolare magneticamente la microglia dai cuccioli neonati.

Isolamento magnetico di cellule microgliali da topo neonato per colture cellulari primarie

Questo protocollo descrive una co-coltura microglia-neuronale stabilita da cellule neuronali primarie isolate da embrioni di topo ai giorni embrionali 15-16 e microglia primaria generata dal cervello di topi neonatali nei giorni post-natali 1-2.

Generazione e co-coltura di microglia primarie murine e neuroni corticali

Impara l'isolamento primario di microglia da cervelli neonatali di ratto mediante colture gliali miste e agitazione meccanica. Questo protocollo fornisce cellule ad alta purezza per studi in vitro sulle funzioni microgliali.

Isolamento primario Microglia misti da colture cellulari gliali del tessuto neonatale cervello di ratto

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