Isolamento primario Microglia misti da colture cellulari gliali del tessuto neonatale cervello di ratto

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare colture primarie di cellule microgliali a partire da cervelli di ratti neonati. Questo viene ottenuto innanzitutto isolando il cervello e rimuovendo le meningi. Il secondo passaggio consiste nell'omogeneizzare il cervello e nel seminare la coltura gliale mista in fiaschi T 75.

Successivamente, i flaconi vengono incubati per 10-14 giorni fino a quando un monostrato di astrociti ha raggiunto la confluenza. L'ultimo passaggio consiste nell'agitare i flaconi per staccare i microglia che crescono sulla superficie del monostrato di astrociti, ottenendo così una coltura purificata di microglia. Alla fine, microglia primarie ad alta purezza possono essere utilizzate in successivi saggi in vitro di coltura cellulare singola e di co-coltura.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il metodo del gradiente di Perico, è che la perturbazione meccanica nominale minimizza la disfunzione o l'attivazione dei microglia, e i microglia per gli esperimenti possono essere ottenuti per settimane dopo la preparazione iniziale. Dimostrerò questa procedura insieme a Tammy Tero, studentessa laureata nel laboratorio del Dottor Clifton Dau guard. Le colture di microglia ad alta purezza ottenute con questo protocollo possono essere utilizzate in esperimenti in vitro per studiare la funzione dei microglia in condizioni fisiologiche normali, nonché in condizioni patologiche di malattia.

La reattività delle microglia ai danni tissutali, così come agli stimoli infiammatori, ha una rilevanza diretta nelle condizioni di lesione neurologica e di malattie neurodegenerative. In generale, le persone alle prime esperienze con questo metodo potrebbero incontrare difficoltà a causa dell'inesperienza nel rimuovere le meningi dal tessuto cerebrale in modo tempestivo, al fine di ridurre la contaminazione da fibroblasti nelle colture primarie di microglia. Inoltre, è necessario prestare attenzione a non danneggiare il monostato di astrociti durante l'agitazione delle fiale e la manipolazione delle colture di microglia.

Per prepararsi alla procedura, raffreddare il mezzo Chi Livi a L 15 a quattro gradi Celsius, preparare piastre di Petri da 60 per 15 millimetri contenenti mezzo L 15 e porle sul ghiaccio. Riscaldare il mezzo di coltura a 37 gradi Celsius ed assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici siano stati sterilizzati. Dopo aver decapitato un ratto neonato da P uno a P cinque con forbici affilate, immergere la testa in etanolo al 70%.

Dopo aver prelevato le teste di cinque ratti neonati, trasferire le teste in soluzione salina. Rimuovere l'intero cervello da ciascuna testa praticando con attenzione delle incisioni su entrambi i lati del cranio al di sopra delle orecchie ed estrarre il cervello, collocandolo in una delle capsule di Petri contenente mezzo L 15 posto sul ghiaccio. Una volta che i primi cinque cervelli sono stati trasferiti nel mezzo L 15 sul ghiaccio, si possono processare successivamente altri cinque ratti nello stesso modo, una volta raccolti tutti i cervelli.

Rimuovere le meningi afferrando delicatamente un bordo del foglio meningeo con una pinzetta ed estraendolo con attenzione dalla corteccia sottostante. È essenziale rimuovere completamente le meningi e farlo nel minor tempo possibile. Dopo aver rimosso le meningi, trasferire ciascun cervello in una nuova capsula di Petri contenente mezzo L 15 su ghiaccio.

Utilizzare una pipetta da 10 millilitri per aspirare il tessuto cerebrale e il mezzo dalla piastra in un tubo conico sterile da 50 millilitri. Quindi centrifugare a 2.500 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifugazione, aspirare.

Quindi, utilizzare una pipetta sterile da 10 millilitri per trasferire il campione in un nuovo tubo. Sospendere il pellet in quattro-cinque millilitri di mezzo L 15 fresco, quindi aspirare e rilasciare il mezzo e il tessuto su e giù per 10 volte. Successivamente, posizionare un filtro cellulare con pori da 100 micron su un nuovo tubo conico da 50 millilitri.

Utilizzare una pipetta sterile da cinque millilitri per aspirare e dispensare più volte la sospensione tissutale, quindi trasferire il materiale attraverso il filtro cellulare nel tubo conico, avendo cura di lavare bene la pipetta nel filtro. Risciacquare il filtro con quattro-cinque millilitri di mezzo L 15 fresco e freddo. Centrifugare quindi a 2.500 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Per ogni cervello di ratto in via di sviluppo processato, preparare una fiala sterile T 75 aggiungendo 12 millilitri di mezzo di coltura preriscaldata in ciascuna fiala. Successivamente, dopo aver aspirato il sopranatante dalle cellule pellettizzate, aggiungere da cinque a sei millilitri di mezzo di coltura al pellet cellulare ed eseguire 10 pipettature su e giù con una pipetta da 10 millilitri. Trasferire quindi un volume uguale di sospensione cellulare in ciascuna fiala T 75.

Incubare i flaconi in un'incubatrice con 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per uno a tre settimane, lasciando le cellule indisturbate per i primi cinque giorni successivi alla semina iniziale. Dopo cinque giorni, sostituire il mezzo condizionato in ciascun flacone con 12 millilitri di mezzo fresco per raggiungere la confluenza. Questa operazione deve essere eseguita con grande attenzione senza toccare il fondo del flacone dove le cellule si attaccano.

Una volta che le colture miste di cellule gliali hanno raggiunto completa confluenza, rimuovere il flacone dall'incubatore. Coprire i tappi dei flaconi con parafilm per prevenire lo scambio gassoso con l'aria ambiente e posizionare i flaconi in un incubatore agitatore impostato a 100 RPS e 37 gradi Celsius per un'ora. Trascorso il tempo, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per raccogliere il mezzo dai flaconi senza disturbare lo strato di astrociti e trasferirlo in provette coniche da 50 millilitri. Aggiungere mezzo fresco ai flaconi e riposizionarli nell'incubatore.

Dopo aver centrifugato i tubi a 2.500 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius, aspirare il soprannatante e risospendere le cellule in un millilitro di mezzo di semina per microglia. Quindi, contare le cellule utilizzando un citometro umano e procedure standard. Una volta determinato il numero di cellule, aggiungere un volume appropriato di mezzo di semina per microglia per ottenere una concentrazione cellulare desiderata.

Una concentrazione di due volte 10 alla cinque cellule per millilitro di piastra è appropriata per l'esperimento; reinserire quindi in incubatore. Lasciare attaccare le microglia durante la notte. Le cellule sono state sottoposte a immunomarcatura con un anticorpo specifico per IBA1, un marcatore delle microglia, che appare di colore rosso.

È presente una contaminazione minima della coltura con cellule neuronali, come dimostrato da questa immagine al microscopio derivante da una immunomarcatura con un anticorpo specifico per il nuovo marcatore neuronale NA, che appare in rosso. Il vetrino è stato controcolorato con DPI per evidenziare in blu tutti i nuclei cellulari. Questa immagine mostra l'immunomarcatura con GFAP, un marcatore degli astrociti.

Gli astrociti appaiono verdi. Qui vediamo un'immagine della coltura di microglia immuno marcata con un anticorpo specifico per CC uno, un marcatore degli oligodendrociti. Gli oligodendrociti appaiono rossi.

Questo istogramma mostra i risultati della quantificazione di ogni tipo cellulare. Si può osservare che le colture di microglia seminate sono pure per oltre il 90%. Questa immagine al microscopio a fluorescenza mostra una coltura di microglia sottoposta a immunomarcatura per IBA1.

Le aree rosse sono microsfere di lattice marcate con fluorescenza. La coltura di microglia mostrata è stata trattata con un nanogrammo per millilitro di lipopolisaccaride, e si può osservare che le cellule microgliali hanno fagocitato le microsfere di lattice marcate con fluorescenza. Qui, i risultati del saggio di fagocitosi sono mostrati in un istogramma.

Un aumento della fagocitosi è osservabile dopo il trattamento con LPS. Questa figura mostra che anche la produzione di ossido nitrico aumenta nelle colture di microglia dopo l'aggiunta di LPS. Infine, sia le colture di neuroni con microglia direttamente a contatto, sia quelle separate mediante inserti transwell, risultano suscettibili a un aumento della morte cellulare dopo incubazione con LPS, come misurato dal rilascio di lattato deidrogenasi. Una volta padroneggiata la prima parte di questa tecnica, fino al travaso in fiaschi T75, l'operazione può essere completata in un'ora e mezza, e l'intera procedura può essere portata a termine entro due settimane.

Un altro aspetto da considerare durante l'ottimizzazione di questo protocollo è la determinazione della durata temporale. Le colture miste di cellule gliali devono essere mantenute per un certo periodo prima dell'isolamento dei microglia primari da seminare, una volta stabilitite colture ad alta purezza. Mediante questa procedura, la funzione dei microglia può essere valutata in vitro misurando la produzione di ossido nitrico, il rilascio di citochine e chemochine, oltre all'attività fasica, tutti parametri determinabili e misurabili mediante saggi di laboratorio di routine.

Pertanto, con lo sviluppo di questa procedura, i ricercatori nel campo delle neuroscienze hanno la possibilità di esplorare l'attività delle microglia in un ambiente cellulare omogeneo e di indagarne il ruolo in diverse condizioni neurologiche. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare colture primarie di cellule microgliali a partire dai cervelli di ratti neonati. Isolando innanzitutto il cervello e rimuovendo le meningi, quindi omogeneizzando il cervello e seminando in fiaschi, questi ultimi vengono poi incubati per 10-14 giorni fino a quando un monocitolo di astrociti ha raggiunto la confluenza.

L'ultimo passaggio consiste nell'agitare i flaconi per staccare i microglia che crescono sulla superficie del monostrato di astrociti, ottenendo così una coltura purificata di microglia.