Isolamento primario Microglia misti da colture cellulari gliali del tessuto neonatale cervello di ratto

Isolamento microglia primaria dalla eterogeneità cellulare del cervello è essenziale per studiare il loro ruolo sia in condizioni fisiologiche e patologiche. Questo protocollo descrive un isolamento meccanico e mista tecnica di coltura cellulare che fornisce alta resa ed elevata purezza, cellule vitali primarie per microgliali

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare colture cellulari microgliali primarie da cervelli di ratto neonatale. Ciò si ottiene isolando prima il cervello e rimuovendo le meningi. Il secondo passo consiste nell'omogeneizzare il cervello e nell'applicare una piastra in coltura gliale mista in fiasche di T 75.

Successivamente, i flaconi vengono incubati per 10-14 giorni fino a quando un monostrato di astrociti ha raggiunto la confluenza. Il passaggio finale consiste nell'agitare i flaconi per rilasciare le microglia che crescono sopra il monostrato di astrociti, ottenendo una coltura purificata di microglia. In definitiva, le microglia primarie ad alta purezza possono essere utilizzate in successive colture in vitro di singole cellule e saggi di co-coltura.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il metodo del gradiente di Perico, è che la disgregazione meccanica nominale riduce al minimo la disfunzione o l'attivazione della microglia, e la microglia per gli esperimenti può essere generata per settimane dopo la preparazione iniziale. Dimostrerò questa procedura insieme a Tammy Tero, una studentessa laureata nel laboratorio della guardia del Dr.Clifton Dau. Le colture di microglia ad alta purezza ottenute durante questo protocollo possono essere utilizzate in esperimenti in vitro per studiare la funzione della microglia in condizioni fisiologiche normali, nonché in condizioni patologiche di malattia.

La microglia, la reattività al danno tissutale e gli stimoli infiammatori hanno una rilevanza diretta per le lesioni neurologiche e le condizioni di malattie neurodegenerative. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché non hanno familiarità con come rimuovere le meningi dal tessuto cerebrale in modo tempestivo al fine di ridurre la contaminazione da fibroblasti nelle colture primarie di microglia. Inoltre, si deve fare attenzione a non danneggiare il monostrato degli astrociti durante l'agitazione dei matracci e la manipolazione delle colture di microglia.

Per prepararsi alla procedura, Chi Livi è un terreno L 15 a quattro gradi Celsius, pronto per piastre di Petri da 60 x 15 millimetri contenenti terreni L 15 e poste su ghiaccio. Riscaldare il terreno di coltura a 37 gradi Celsius e assicurarsi che tutti gli strumenti chirurgici siano stati sterilizzati. Dopo aver decapitato un cucciolo di ratto P uno a P cinque con forbici affilate, lascia cadere la testa in etanolo al 70%.

Dopo che le teste di cinque cuccioli di ratto sono state raccolte, trasferire le teste in soluzione salina. Rimuovere l'intero cervello da ciascuna testa praticando con cura incisioni su entrambi i lati del cranio sopra le orecchie ed estraendo il cervello e immergendolo in uno dei problemi di Petri contenenti terreno L 15 su ghiaccio. Una volta che i primi cinque cervelli sono stati trasferiti in L 15 su ghiaccio, i successivi cinque cuccioli possono essere processati allo stesso modo quando tutti i cervelli sono stati raccolti.

Rimuovere le meningi afferrando delicatamente un bordo del foglio meningeo con una pinza e staccandolo con cura dalla corteccia sottostante. È essenziale rimuovere accuratamente le meningi e farlo il più rapidamente possibile. Dopo aver rimosso le meningi, trasferire ciascuno dei cervelli in una capsula di Petri fresca di L 15 medium su ghiaccio.

Utilizzare una pipetta da 10 millilitri per aspirare il tessuto cerebrale e il terreno dalla piastra in una provetta conica sterile da 50 millilitri. Quindi centrifugare a 2.500 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo centrifugazione aspirare.

Il supinato utilizza quindi una pipetta sterile da 10 millilitri per Reese. Sospendere il pellet in quattro o cinque millilitri di terreno fresco L 15, pipettare il terreno e il fazzoletto su e giù per 10 volte. Quindi posizionare un filtro a cellule di pori da 100 micron su un tubo conico fresco da 50 millilitri.

Utilizzare una pipetta sterile da cinque millilitri per pipettare la sospensione tissutale su e giù, quindi con la pipetta lavata sul filtro cellulare, erogare il materiale attraverso il filtro cellulare nel tubo conico. Sciacquare il colino con quattro o cinque millilitri di terreno L 15 fresco e freddo. Quindi centrifuga i tuoi 2.500 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Per ogni cervello di cucciolo di ratto processato, preparare un pallone sterile T 75 aggiungendo 12 millilitri di terreno di coltura prebellico in ogni pallone. Successivamente, dopo aver aspirato il supplante dalle cellule pellettate, aggiungere da cinque a sei millilitri di terreno di coltura al pellet cellulare, pipettare su e giù 10 volte con una pipetta da 10 millilitri. Quindi trasferire un volume uguale di sospensione cellulare in ciascun matraccio T 75.

Incubare i flaconi in un incubatore al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per una o tre settimane, consentendo alle cellule di rimanere indisturbate per i primi cinque giorni dopo la placcatura iniziale. Dopo cinque giorni, sostituire il terreno condizionato in ciascun pallone con 12 millilitri di terreno fresco per ottenere la confluenza. Questo deve essere fatto con molta attenzione senza toccare il fondo del pallone dove si attaccano le cellule.

Una volta che le colture gliali miste sono completamente confluite, rimuovere il pallone dall'incubatore. Coprire i tappi dei matracci con dei param per evitare lo scambio di gas con l'aria ambientale e posizionare i flaconi in un incubatore di agitazione impostato a 100 RPS e 37 gradi Celsius per un'ora dopo che è trascorsa l'ora, utilizzare una pipetta da 10 millilitri per raccogliere il terreno dai flaconi senza interrompere lo strato di astrociti ed erogare in provette coniche da 50 millilitri. Aggiungere il terreno fresco ai palloni e rimetterlo nell'incubatrice.

Dopo aver centrifugato le provette a 2.500 RCF per cinque minuti a quattro gradi Celsius, aspirare il supinato e risospendere le cellule in un millilitro di terreno di placcatura per microglia. Quindi contare le cellule utilizzando un citometro umano e procedure standard. Una volta determinato il numero di cellule, aggiungere un volume appropriato di terreno di placcatura microgliale per ottenere una cellula.

La concentrazione di due volte 10 per la piastra di cinque cellule per millilitro è appropriata per l'esperimento e il ritorno all'incubatore. Per consentire alla microglia di attaccarsi durante la notte. Le cellule sono state immunocolorate con un anticorpo specifico per IBA uno, un marcatore microgliale, che appare rosso.

La contaminazione della coltura con cellule neuronali è minima, come dimostrato da questa immagine al microscopio della colorazione immunologica utilizzando un anticorpo per il nuovo marcatore neuronale NA, che appare rosso. Il vetrino è stato colorato con DPI per colorare di blu tutti i nuclei cellulari. Questa immagine mostra la colorazione immunologica con GFAP e marcatore astrocitario.

Gli astrociti appaiono verdi. Qui vediamo un'immagine della coltura microgliale immuno colorata con un anticorpo specifico per CC one, un marcatore di oligodendrociti. Gli oligodendrociti appaiono rossi.

Questo istogramma mostra i risultati della quantificazione di ciascun tipo di cellula. Si può vedere che le colture microgliali piastrate sono pure per oltre il 90%. Questa immagine al microscopio a fluorescenza mostra una coltura microgliale che è stata immunocolorante per IBA.

Le aree rosse sono perline di lattice etichettate in modo fluorescente. La coltura microgliale mostrata qui è stata trattata con un nanogrammo per millilitro di polisaccaride lipo e si può vedere che le cellule microgliali hanno fagocitosi le perle di lattice marcate in modo fluorescente. Qui, i risultati del test di fagocitosi vengono visualizzati in un istogramma.

Si osserva un aumento della fagocitosi dopo il trattamento con LPS. Questa figura mostra che la produzione di ossido nitrico aumenta anche nelle colture microgliali dopo l'aggiunta di LPS. Infine, le colture di neuroni della microglia separate con inserto diretto o transwell sono suscettibili di un aumento della morte cellulare dopo l'incubazione con LPS, misurata dal rilascio di lattato deidrogenasi Una volta padroneggiata la prima parte di questa tecnica, fino alla placcatura in T 75, le fiasche possono essere eseguite in un'ora e mezza e l'intera procedura può essere eseguita entro due settimane.

Un'altra considerazione durante l'ottimizzazione di questo protocollo è determinare la durata del tempo. Le colture gliali miste devono essere mantenute prima di isolare la microglia primaria per la piastratura Dopo l'istituzione di colture ad alta purezza. Utilizzando questa procedura, la funzione della microglia può essere valutata in vitro, la misurazione della produzione di ossido nitrico, il rilascio di citochine e chemochine, nonché l'attività fasica, possono essere determinate e misurate utilizzando saggi di laboratorio di routine.

Pertanto, con lo sviluppo di questa procedura, i ricercatori nel campo delle neuroscienze hanno la capacità di esplorare l'attività della microglia in un ambiente cellulare omogeneo e di studiare i loro ruoli in varie condizioni neurologiche. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare colture cellulari microgliali primarie da cervelli di ratto neonatale. Isolando prima il cervello e rimuovendo le meningi, quindi omogeneizzando il cervello e trasformandolo in fiasche, le fiasche vengono incubate per 10-14 giorni fino a quando un monostrato di astrociti non ha raggiunto la confluenza.

Il passaggio finale consiste nell'agitare le fiasche per rilasciare le microglia che crescono sopra il monostrato degli astrociti, ottenendo una coltura purificata di microglia.