Imaging cellulare mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale

Inizia con una configurazione al microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF) con una camera di imaging coperta contenente un vetrino coprioggetti con cellule di neuroblastoma umano aderenti in un tampone.

Queste cellule esprimono fluorofori specifici delle membrane delle vescicole sinaptiche.

In modalità epifluorescenza, selezionare una cellula per l'imaging.

In modalità TIRF, attraverso l'obiettivo, dirigere un laser verso il campione, che appare come un punto sul coperchio.

Regolare l'angolo in modo da superare l'angolo critico all'interfaccia tra il vetrino coprioggetti ad alto indice di rifrazione e il campione a basso indice di rifrazione, provocando la riflessione interna totale (TIR), vista come una linea sottile.

TIR genera un'onda evanescente che eccita i fluorofori sulla membrana più vicina.

La fluorescenza emessa viene raccolta dall'obiettivo e catturata da una telecamera.

Ottimizza per ottenere un'immagine ad alto contrasto della membrana cellulare vicino al vetrino coprioggetti.

Ottimizza le impostazioni di acquisizione per ridurre al minimo il fotobleaching e impostare la frequenza di campionamento.

Inizia l'imaging TIRF per visualizzare le vescicole sinaptiche fuse.

In modalità epifluorescenza, concentrarsi sul vetrino coprioggetti e scegliere le cellule trasfettate posizionate al centro della camera. Sotto il controllo del software, passare all'illuminazione del tappeto erboso in modalità live. Per impostare la configurazione del manto erboso, verificare la posizione del raggio che fuoriesce dall'obiettivo sulla copertura del campione. Quando il raggio è posizionato al centro della lente dell'obiettivo, è visibile una macchia al centro della copertura del campione di tappeto erboso e la cellula viene ripresa in modalità epifluorescenza.

Per raggiungere l'angolo critico, spostare il punto focalizzato in direzione Y utilizzando la vite di regolazione dell'angolo sul cursore del tappeto erboso. Quando il raggio converge sul piano del campione con un angolo maggiore dell'angolo critico, la macchia scompare e al centro del coperchio del campione è evidente una linea diritta, sottile e focalizzata. Per regolare con precisione l'angolo del tappeto erboso, utilizzare un campione di celle.

Guarda l'immagine a fluorescenza nel video. In questa fase, un'immagine simile all'epifluorescenza è ancora visibile. Spostare delicatamente la vite fino a raggiungere le condizioni del manto erboso. In questo caso, solo un piano ottico della cella è a fuoco, risultando in un'immagine piatta con un contrasto elevato.

Per eseguire l'imaging del campione, impostare l'esperimento time lapse a canale singolo. I tempi di esposizione appropriati sono compresi tra 40 e 80 millisecondi. Acquisizione di immagini con frequenza di campionamento di 1 o 2 Hertz.