Microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per la visualizzazione di eventi esocitici

Inizia con un piatto con fondo di vetro contenente neuroni corticali embrionali su un tavolino al microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale o TIRF.

Questi neuroni esprimono una proteina fluorescente verde sensibile al pH o un marcatore di vescicole marcate con GFP che emette fluorescenza a pH extracellulare neutro ma rimane non fluorescente nelle vescicole acide.

Dopo la fusione delle vescicole con la membrana plasmatica, l'esposizione al pH extracellulare induce la fluorescenza, marcando l'evento di esocitosi.

Seleziona l'obiettivo e imposta l'indice di rifrazione in modo che corrisponda al neurone.

Dirigere il raggio laser ad angolo rispetto al vetro, il che provoca una riflessione interna totale e genera un'onda evanescente. Questa onda eccita selettivamente i marcatori GFP vicino alla membrana plasmatica.

Impostare la profondità di penetrazione TIRF per escludere i marcatori GFP al di sopra del campo evanescente.

Innanzitutto, utilizzare l'illuminazione a epifluorescenza a campo largo per localizzare i neuroni che esprimono GFP.

Quindi, passare all'illuminazione TIRF per l'eccitazione specifica della membrana.

Acquisisci immagini time-lapse per registrare l'evento di fusione delle vescicole e visualizzare l'esocitosi.

Dopo aver impostato il microscopio TIRF e il campione e aver trovato un piano focale neuronale secondo il protocollo di testo, avviare il software laser e collegarsi al software di controllo laser. Impostare l'illuminazione su campo ampio e selezionare l'obiettivo. Quindi impostare l'indice di rifrazione del campione e regolare l'intensità del laser deselezionando TTL per il laser 491.

L'ottimizzazione dei parametri di imaging è importante durante l'imaging di vescicole esocitiche intatte sul pavimento per evitare la deriva della messa a fuoco e la fototossicità, producendo immagini con un elevato rapporto segnale/rumore sufficiente per l'analisi.

Regolare il dispositivo di scorrimento su 100, quindi riportarlo a un valore compreso tra 20 e 40. Quindi ricontrolla il TTL. Quindi, concentrarsi nuovamente sul campione in illuminazione a luce trasmessa.

Quindi, nel software di imaging, selezionare l'illuminazione laser 491 e aprire l'otturatore. Posizionare il condensatore capovolto sul banco ottico in modo da non graffiare la lente. Regola con precisione il punto focale del laser sul soffitto.

E con il condensatore rimosso, centrare il punto al centro del diaframma a campo chiuso. Quindi sostituire il condensatore. E nel software TIRF, impostare la profondità di penetrazione su 110 nanometri. Quindi passa dall'illuminazione ad ampio campo alla modalità di illuminazione TIRF per l'imaging.

Ora, utilizzando l'epifluorescenza ad ampio campo, trova le cellule che esprimono fiorina VAMP2 attraverso gli oculari. Quindi, per ridurre il fotobleaching e la fototossicità, regolare i parametri di imaging per massimizzare il rapporto segnale/rumore e la gamma dinamica utilizzando un tempo di esposizione e un'intensità laser minimi. Imposta la messa a fuoco automatica continua per cella. Quindi acquisire un set di immagini time lapse con acquisizione che avviene ogni 0,5 secondi per 5 minuti.