Microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per la visualizzazione di eventi esocitici

Inizia con un piatto con fondo di vetro contenente neuroni corticali embrionali su un tavolino al microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale o TIRF.

Questi neuroni esprimono una proteina fluorescente verde sensibile al pH o un marcatore di vescicole marcate con GFP che emette fluorescenza a pH extracellulare neutro ma rimane non fluorescente nelle vescicole acide.

Dopo la fusione delle vescicole con la membrana plasmatica, l'esposizione al pH extracellulare induce la fluorescenza, marcando l'evento di esocitosi.

Seleziona l'obiettivo e imposta l'indice di rifrazione in modo che corrisponda al neurone.

Dirigere il raggio laser ad angolo rispetto al vetro, il che provoca una riflessione interna totale e genera un'onda evanescente. Questa onda eccita selettivamente i marcatori GFP vicino alla membrana plasmatica.

Impostare la profondità di penetrazione TIRF per escludere i marcatori GFP al di sopra del campo evanescente.

Innanzitutto, utilizzare l'illuminazione a epifluorescenza a campo largo per localizzare i neuroni che esprimono GFP.

Quindi, passare all'illuminazione TIRF per l'eccitazione specifica della membrana.

Acquisisci immagini time-lapse per registrare l'evento di fusi