Differenziazione Regia di cellule staminali pluripotenti indotte verso Linfociti T

L'obiettivo generale di questa procedura è generare e caratterizzare linfociti T da cellule staminali pluripotenti indotte o IPS. Le cellule IPS possono quindi essere differenziate in vitro su un sistema di coltura OP nine DL one e quindi maturate in vivo in un topo carente di straccio. Oppure le cellule possono essere geneticamente modificate per sovraesprimere OT one TCR e quindi trasferite adottivamente per lo sviluppo in vivo.

Dopo sei settimane di differenziazione in vivo, i topi possono essere sfidati mediante iniezione intraperitoneale con EEG di sette cellule tumorali e quindi può essere valutata la specificità dell'antigene delle cellule T derivate da IPS. In definitiva, le cellule IPS possono differenziarsi sia in cellule T convenzionali che in cellule T specifiche per l'antigene, queste ultime in grado di proteggere gli animali dalla sfida tumorale. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso l'immunoterapia del cancro individualizzata.

Il metodo consente una generazione di un gran numero di cellule T reattive al tumore deriva da una quantità minima di sangue o tessuto cutaneo del paziente Il giorno zero trasferire cinque volte 10 alla quarta cellula IPS su un piatto di coltura da 100 millimetri contenente un monostrato confluente di OP nove, DL una cellula in 20% di terreno alfa MEM FBS il quinto giorno, occhi di tripsina. Quindi centrifugare le cellule dopo averle incubate su una piastra di coltura fresca da 100 millimetri per 30 minuti e una piastra incubatrice a 37 gradi, cinque volte 10 al quinto delle cellule galleggianti in 20% FBS alfa, media MEM e tre ligandi piatti di topo su una nuova piastra da 100 millimetri contenente un monostrato di OP nove. Le cellule DL 1 l'ottavo giorno pipettano delicatamente le cellule attaccate in modo lasco, centrifugano le cellule e quindi trasferiscono le cellule in un singolo pozzetto di una piastra di coltura a sei pozzetti rivestita con OP confluente nove cellule DL 1 incubano le cellule a 37 gradi Celsius, 5% di anidride carbonica per altre due settimane il giorno 22.

Incubare le cellule IPS staccate in terreno fresco su un nuovo piatto di coltura a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi rimuovere circa la metà delle celle galleggianti e passarle attraverso un colino di nylon da 70 micron per escludere i grumi di cellule e lavare la sospensione a cellula singola risultante tre volte con PBS freddo. Dopo il terzo lavaggio, risospendere le cellule in PBS a 1,5 volte il decimo delle settime cellule per millilitro e mantenere le cellule sul ghiaccio prima dell'iniezione endovenosa.

Metti un topo carente di stracci di quattro settimane sotto una luce a infrarossi per dilatare la vena della coda. Quindi riempire una siringa da un millilitro dotata di un ago calibro 26 e mezzo con 200 microlitri di sospensione cellulare e trasferire adottivamente le cellule attraverso la vena caudale dilatata. Tre settimane dopo aver confermato l'eutanasia del topo trasferito in modo adottivo, rimuovere i linfonodi e la milza dopo aver scomposto meccanicamente i tessuti.

Licare la sospensione a cellula singola con un tampone di lisi CK e quindi lavare due volte i citi mononucleo risultanti in PBS freddo. Quindi, dopo la colorazione per i marcatori della superficie cellulare, valutare le cellule mediante analisi citofluorimetrica il giorno zero, utilizzare il reagente di trasfezione genica JAMA per trasfettare le cellule di imballaggio della piastra E placcate durante la notte con un OT un MIDR il seme del primo giorno una volta 10 per le sei cellule IPS in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti precodificata in gelatina allo 0,1% il secondo giorno, raccogliere lo pseudo virus contenente S natin dalle cellule E della plat e quindi passarlo attraverso un filtro da 0,4 micron per escludere potenziali contaminanti dopo la centrifugazione. Trasduzione delle cellule in presenza di poli cervello per un'ora a 330 volte G a 32 gradi Celsius.

Incubarli per una notte alla stessa temperatura dopo aver ripetuto la procedura di trasduzione. La tripsina osserva le cellule IPS trasdotte il quarto giorno e poi, dopo la pellettatura, le cellule sospendono nuovamente le cellule in terreni freschi e le seminano su cellule di alimentazione snl 7 6 7 irradiate precodificate. Una volta che le cellule trasdotte hanno raggiunto la confluenza, selezionare le cellule rosse doppie positive GFP e DS mediante citometria a flusso.

Sei settimane dopo il trasferimento adottivo delle cellule IPS, iniettare 50 microlitri di EEG, sette cellule thoma nella cavità peritoneale dello stesso topo il giorno 50 della sfida tumorale. Utilizzare un kit di isolamento delle otto cellule T positive mil E biotech CD per selezionare le otto cellule T positive CD dalla milza e dai linfonodi dell'animale trasferito in modo adottivo. Mescolare le cellule T CD-otto positive isolate con SPOC irradiate da un topo C 57 nero 6 J naïve con un rapporto da uno a 10 e pulsare la co-coltura con 0,5 micromoli per mil di ovuli per 40 ore.

Successivamente, aggiungere il felden A alle celle per altre quattro ore. Infine, valutare le popolazioni cellulari mediante analisi citofluorimetrica Dopo aver isolato i citi SP da un topo C 57 nero sei J naive. Dividere la sospensione cellulare in due gruppi.

Etichettare il gruppo CFSE alto con cinque micromoli per mil di CFSE e pulsare le cellule con 10 microgrammi per mil di peptide ovulo per un'ora, etichettare il gruppo A-C-F-S-E basso con 0,5 MICROMOLE per mil di CFSE e non pulsare. Mescolare 2,5 volte 10 alla sesta, le celle alte CFSE con 2,5 volte 10 alla sesta, le celle basse CFSE in PBS. Quindi analizzare i citi mediante citometria a flusso per l'espressione di CFSE.

16 ore dopo il trasferimento adottivo nel topo di interesse Per contare le cellule tumorali intraperitoneali il giorno 20 della provocazione del tumore. Utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di ago da 18 gauge e mezzo e PBS freddo per lavare la cavità peritoneale. Contare le cellule tumorali recuperate per identificare le cellule infiltranti il tumore.

Rimuovere il tumore in una fase avanzata della provocazione tumorale e quindi tagliare il tumore in tre pezzi. Metti il primo pezzo di tumore in una fiala criogenica e posiziona la fiala su ghiaccio secco. Fissare immediatamente il secondo pezzo di formaldeide.

Conservare il terzo pezzo in un terreno condizionato RPMI 1640 dopo aver asciugato all'aria le sezioni di tessuto crioconservate. Fissarli in acetone freddo per 15 minuti dopo aver asciugato all'aria le sezioni fisse per altri 15 minuti. Lavare i vetrini per cinque minuti in PBS dopo il lavaggio.

Posizionare i vetrini in una camera umida e coprire le sezioni di tessuto con 30 microlitri di 3%B, SA e PBS per 30 minuti per bloccare il legame aspecifico. Quindi tamponare il tampone bloccante e incubare le sezioni di tessuto con una miscela da 50 microlitri di anticorpo pe anti TCR RV alpha two e anticorpo fitzy anti ova diluito in 3% PSA in PBS in camera umida per due ore al termine dell'incubazione. Lavare i vetrini tre volte in PBS freddo, infine montare le sezioni con un mezzo di montaggio a base d'acqua prima dell'esame microscopico fluorescente per l'analisi citofluorimetrica delle cellule T infiltranti il tumore.

Schiacciare il tumore in una sospensione a cellula singola. Quindi analizza le celle alla ricerca di marcatori di superficie specifici. C, CD, tre, e TCR beta sono utilizzati come marcatori delle cellule T per determinare se la stimolazione delle cellule IPS con il ligando notch DL uno potrebbe contribuire all'espressione della superficie delle cellule T, CD quattro e CD otto, su cellule derivate da cellule CD, tre positive, TCR r beta positive, IPS derivate da cellule derivate da cellule CD, tre.

Si noti il dot plot a destra che mostra il giorno 22: CD, tre TCR R, beta positivi, CD, quattro CD negativi, otto cellule T singole positive generate da cellule IPS in vitro. Inoltre, le singole cellule positive derivate dalle cellule IPS dalla figura precedente hanno prodotto l'interleuchina due e l'interferone gamma quando stimolate in vitro da anticorpi anti CD tre rivestiti su piastra e anticorpi solubili anti CD 28, confermando che le cellule T derivate dalle cellule IPS sono funzionali dopo il trasferimento adottivo nei topi riceventi. La maggior parte delle cellule IPS trasdotte dal gene TCR è stata differenziata in CTL positivi al gene CD, che hanno risposto in vitro alla stimolazione peptidica secernendo interleuchina 2 e interferone gamma in questi dot plot da cellule linfonodali e della milza raggruppate.

CD, otto cellule T V positive, beta cinque positive sono state generate in topi trasferiti adottivamente con TCR Trasdotto ma non con cellule IPS trasdotte di controllo. Le popolazioni CD, otto V, beta cinque positive erano positive per la colorazione intracellulare delle citochine per l'interleuchina 2 e la produzione di interferone gamma, rappresentate in questi istogrammi dalle linee scure rispetto agli istogrammi di controllo dell'isotipo ombreggiato, indicando che i CTL derivati da IPS erano funzionali. Questi dati mostrano che le cellule CFSE alte pulsavano con eptide rappresentato dai picchi a destra in ciascun grafico e le cellule di controllo CFSE basse rappresentate dai picchi a sinistra che sono state iniettate nei topi 10 settimane dopo il trasferimento delle cellule IPS o un giorno dopo il trasferimento di O OT un CTL.

I CTL derivati da IPS antigene-specifici hanno risposto alla stimolazione dell'antigene e hanno avuto attività citotossica, come indicato dall'assenza di cellule CFSE elevate. OT una cellula IPS trasdotta dal gene TCR è stata trasferita in modo adottivo in C 57, sei topi neri e poi i topi sono stati sottoposti a sfida con EEG, sette cellule tumorali al giorno 20 sono state enumerate le cellule tumorali nella cavità peritoneale. Si noti la significativa riduzione del numero di cellule tumorali nei topi che hanno ricevuto IPS TRASDOTDOTTO TCR rispetto ai gruppi di controllo.

Ancora più importante, il trasferimento adottivo di cellule IPS TRDUCENTI TCR ha innescato l'infiltrazione di CTL iperreattivi nei tessuti tumorali e ha protetto gli animali dalla sfida tumorale, come si è visto in questa colorazione h ed e dei tessuti tumorali recuperati giorni da 30 a 35 giorni dopo la sfida tumorale tumori da topi trasferiti adottivamente con cellule trasdotte TCR o CTL OT one ma non simulati iniettati o di controllo. Le cellule trasdotte sono state infiltrate da cellule infiammatorie, come indicato dalle frecce rosse qui. È stato riscontrato che i CTL V alfa due positivi in rosso si infiltrano nei tessuti tumorali che esprimono ovuli in verde.

Mentre i tumori nei topi dei gruppi di controllo avevano meno o nessuna cellula infiltrante il tumore in questa figura, le sospensioni di singole cellule dai tessuti tumorali sono state analizzate per l'espressione della positività V alfa due e della positività V beta cinque mediante citometria a flusso dopo aver eseguito il gating sulla popolazione CD otto positiva. Si noti che i tessuti tumorali dei topi trasferiti in modo adottivo con le cellule IPS trasdotte TCR hanno mostrato il più alto livello di cellule infiltranti il tumore, mentre i tumori dei topi che hanno ricevuto il controllo. L'IPS trasdotto non ha mostrato infiltrazione da parte di otto cellule T positive CD specifiche per ovuli.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare cellule T specifiche per l'antigene dalle cellule IPS e di come valutare le funzioni delle cellule T derivate dall'IPS.