Generazione di singole cellule T CD8 positive da cellule staminali pluripotenti indotte

Cellule staminali pluripotenti indotte da coltura su uno strato di alimentazione di cellule stromali su una matrice di gelatina.

Lo strato di alimentazione imita l'ambiente extracellulare naturale, guidando la differenziazione delle cellule staminali in organoidi a forma di cupola contenenti cellule progenitrici ematopoietiche.

Aggiungere enzimi per dissociare le cellule co-coltivate.

Trasferire le cellule in un piatto fresco ricoperto di gelatina per l'adesione delle cellule stromali.

Raccogliere le cellule progenitrici ematopoietiche non aderenti in un mezzo di differenziazione.

Coltivali su uno strato di alimentazione fresco per promuovere la differenziazione delle cellule progenitrici in cellule T doppie positive con recettori CD4 e CD8 e cellule T doppie negative prive di entrambi i recettori.

Trasferire le cellule in una provetta. Incubarli con perle magnetiche che trasportano anticorpi specifici per CD4 che marcano selettivamente le cellule T doppie positive.

Utilizzare un separatore magnetico per isolare le cellule a doppia positività e coltivarle su uno strato di alimentazione fresco.

Integrare con un mix di citochine e anticorpi per stimolare le cellule, inducendo la sottoregolazione del recettore CD4 e promuovendo la loro differenziazione in cellule CD8-single positive.

Preparare le piastre gelatinizzate OP9-delta-1 una settimana prima della co-coltura con IPSC umane. Aggiungere 4 millilitri di gelatina allo 0,1% a tre nuovi piatti di coltura cellulare e incubarli per 30 minuti a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aspirare la gelatina e aggiungere 8 millilitri di terreno OP9 a ciascun piatto. Passaggio di una piastra confluente di cellule OP9-delta-1 a tre piastre rivestite di gelatina.

Dopo quattro giorni, aggiungere 10 millilitri di terreno OP9 a ciascuna piastra di cellule per un totale di 20 millilitri di terreno per piastra. Iniziare la co-coltura di IPSC umana su piastre di confluenza OP9-delta-1 da sette a otto giorni dopo il passaggio delle cellule. Aspirare il terreno da una capsula confluente di IPSC umane e aggiungere 10 millilitri di terreno OP9.

Taglia e stacca le colonie cellulari utilizzando uno strumento di passaggio cellulare usa e getta e trasferisci da 350 a 600 grumi di colonie tagliate su una piastra OP9-delta-1 pregelatinizzata con 10 millilitri di terreno OP9 fresco. Scuoti il piatto di coltura da un lato all'altro e dalla parte anteriore a quella posteriore per garantire una distribuzione uniforme delle colonie. Il giorno successivo, aspirare il terreno esaurito e sostituirlo con 20 millilitri di terreno OP9 fresco.

I grumi di IPSC umani co-coltivati su OP9-delta-1 per un giorno dovrebbero apparire come piccole colonie monostrato rotonde. Il giorno 5, aspirare 10 millilitri di terreno esaurito e aggiungere 10 millilitri di terreno OP9 fresco. Le colonie inizieranno a differenziarsi nel mesoderma primitivo, che è caratterizzato da un centro scuro multistrato.

Ripeti questo processo il giorno 9, a quel punto le strutture centrali multistrato si evolveranno in forme a cupola. Raccogli le cellule progenitrici ematopoietiche il giorno 13, a quel punto le strutture sono composte da un organoide centrale scuro circondato da una rete di aree a cupola. Aspirare il terreno e lavare le cellule una volta con 5 millilitri di 1x soluzione salina bilanciata di Hank senza rosso fenolo con calcio e magnesio o HBSS.

Dopo il lavaggio, aggiungere 250 microlitri di 5.000 unità per millilitro di collagenasi-4 a 10 millilitri di HBSS. Aggiungere il composto alle cellule e incubarle a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Aspirare la miscela HBSS-collagenasi e lavare le cellule una volta con 5 millilitri di PBS. Dopo il lavaggio con PBS, aggiungere 5 millilitri di tripsina-EDTA allo 0,25% e incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 20 minuti.

Quindi, aggiungere 4 millilitri di terreno OP9 e associare lo strato cellulare mediante pipettaggio per ottenere una sospensione a cellula singola. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 millilitri attraverso un colino da 100 micrometri e centrifugare la provetta a 300 volte g e 4 gradi Celsius per 5 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 10 millilitri di terreno OP9.

Piastra la sospensione cellulare su un nuovo piatto di coltura cellulare gelatinizzato da 10 centimetri e incubale a 37 gradi Celsius per 45 minuti. Quindi, raccogliere le cellule non aderenti mediante pipettaggio delicato. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 50 millilitri attraverso un colino e centrifugare come descritto in precedenza. Quindi, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 10 millilitri di terreno di differenziazione.

Placcare la sospensione cellulare su un nuovo piatto confluente OP9-delta-1. Passare le celle il giorno 16 secondo le indicazioni del manoscritto e continuare a far passare le celle non aderenti ogni cinque o sette giorni successivi. Dopo 35 giorni di differenziazione, arricchire la popolazione cellulare CD4-positiva mediante isolamento con biglie magnetiche CD4 secondo il protocollo del produttore.

Quindi, risospendere le cellule in terreno OP9 e disporre di 1 millilitro di sospensione cellulare in ciascun pozzetto di una piastra a fondo piatto a fondo piatto da 24 pozzetti di OP9-delta-1 confluente. Stimolare le cellule aggiungendo 100 unità internazionali di IL-2 umana, 5 nanogrammi di IL-7 umana, 500 nanogrammi di anticorpi CD3 anti-umani e 2 microgrammi di anticorpi CD28 anti-umani a ciascun pozzetto. Dopo quattro-sette giorni, le cellule possono essere raccolte per ulteriori analisi.