Elaborazione di mastoplastica riduttiva e tessuti umani mastectomia per coltura cellulare

Questo protocollo mira a isolare le parti epiteliali della ghiandola mammaria libere dalle cellule stromali mammarie associate. Iniziare con la dissezione accumulata del materiale di scarto chirurgico per arricchirlo per le strutture epiteliali utilizzando la digestione enzimatica. Separare gli organoidi epiteliali dal materiale stromale al di fuori della membrana basale.

Quindi elaborare gli organoidi digeriti attraverso filtri cellulari di dimensioni fisse per ottenere frazioni arricchite. Semina gli organoidi per la coltura immediata o congela le scorte per un uso futuro. In definitiva, gli organoidi epiteliali vengono utilizzati per generare colture a lungo termine di cellule epiteliali mammarie umane normali.

Ho sviluppato questo metodo per la prima volta alla fine degli anni '70 al fine di far progredire il campo della biologia delle cellule epiteliali umane e della cancerogenesi. Era disponibile abbondante materiale chirurgico di scarto dai normali tessuti della memoria umana. Ciò di cui c'era bisogno era un metodo per elaborare questo materiale eterogeneo di massa per renderlo adatto alla coltura di cellule epiteliali pure e ai terreni per supportare la crescita a lungo termine.

La dimostrazione visiva di questo metodo è utile, in particolare per notare come eseguire la dissezione grezza. Che aspetto hanno gli organoidi correttamente digeriti? Filtraggio degli organoidi e impiattamento degli organoidi per la coltura.

Il vantaggio di questa tecnica è che fornisce frazioni epiteliali pulite per lo stroma e le cellule epiteliali rimangono intatte. Gli organoidi, che abbiamo trovato, danno la migliore crescita iniziale e massimizzano il numero di cellule che si possono ottenere. Due scienziati del Lawrence Berkeley National Laboratory, James Garvey e Mark LeBarge dimostreranno ora questa procedura dal materiale scartato delle procedure chirurgiche.

Ottenere tessuto mammario umano in contenitori sterili contenenti tampone o terreno completo più antibiotici a quattro gradi Celsius. Tagliare dei pezzi di tessuto e metterli in un grande piatto sterile di vetro. Separare le aree epiteliali dalla matrice stromale del tessuto adiposo, del tessuto connettivo e dei vasi sanguigni.

Sezionare delicatamente i filamenti bianchi delle aree epiteliali incorporate nella matrice stromale più gialla. Tenere il materiale con una pinza e raschiare via il materiale grossolanamente grasso con un bisturi. Quindi, con bisturi opposti, tagliare il tessuto epiteliale in pezzi di circa quattro millimetri per facilitare la digestione.

Trasferire il tessuto epiteliale sezionato in una provetta da centrifuga conica da 50 o 15 millilitri in tessuto fortemente fibroso. Ci sarà più materiale non epiteliale bianco solido. Se è difficile sezionare le cellule epiteliali da tali matrici fibrose.

Il fazzoletto può essere tagliato in pezzi quadrati da uno a tre millimetri e digerito separatamente. Riempire la provetta con il mezzo di digestione contenente collagenasi grezza e giorni ad alto contenuto di alluminio, lasciando un piccolo spazio d'aria per consentire la miscelazione durante la rotazione. Incubare il campione per una notte a 37 gradi Celsius su un rotatore a 360 gradi a otto giri/min Dopo la digestione.

Pellettare i campioni mediante centrifugazione 600 G per cinque minuti. Scartare il grasso e il mezzo surnatante seguendo le linee guida istituzionali per lo smaltimento del tessuto umano. Per monitorare la digestione dei tessuti, diluire un piccolo Eloqua del pellet in terreno ed esaminare al microscopio in organoidi completamente digeriti che mostreranno lo stroma attaccato.

Ripetere la digestione enzimatica fino a quando il tessuto non è completamente digerito in organoidi puri. Se è necessaria una seconda digestione notturna, potrebbe essere necessario ridurre la concentrazione di enzimi per prevenire una digestione eccessiva. Gli organoidi correttamente digeriti mostreranno strutture alveolari duttali o alveolari duttali dall'aspetto liscio, prive di stroma attaccato.

Quando la digestione è completa, sospendere nuovamente il pellet finale in antibiotici a medio posizionamento. Passare il campione digerito in quat attraverso un colino sterile da 100 micron su una provetta sterile da 50 millilitri. Dopo che il terreno è stato drenato nella provetta, lavare gli organoidi con tre millilitri di terreno.

Ripetere l'operazione fino a quando tutto il pellet risospeso è stato trasferito. Quindi capovolgere con cura il filtro su una provetta sterile e lavare gli organoidi nella provetta con altro terreno. Questo è il pool di organoidi da 100 micron.

Ora passare il materiale che è stato drenato nel tubo originale da 50 millilitri attraverso un filtro da 40 micron per separare le strutture alveolari dal pool di filtrati di singole cellule e piccoli grumi di cellule mesenchimali ed epiteliali e piccoli pezzi di tessuto vascolare. Centrifugare le piscine da 100 micron 40 micron e filtrate a 600 G per cinque minuti. Ricostituire ogni campione utilizzando un millilitro di ccpm.

Due soluzioni di congelamento per 0,1 millilitro di palato confezionato. Mantieni a quattro gradi Celsius. Posizionare con cura 0,1 millilitri di ciascuno dei due pool di organoidi.

Goccia a goccia in distribuzione uniforme su uno o 2 piatti da 35 millimetri. Evitare di graffiare la superficie del piatto dopo alcuni minuti dall'inizio dell'applicazione degli organoidi. Aggiungere lentamente i terreni di coltura per evitare di rimuovere gli organoidi.

Quindi incubare le colture primarie a 37 gradi Celsius in un incubatore a CO2 umidificato. Seminare anche 0,1 millilitri del pool di filtrati direttamente su plastica per colture tissutali con terreno fibroblastico. Incubare le colture primarie a 37 gradi Celsius in un incubatore a CO2 umidificato.

Dopo 24-48 ore, controllare la migrazione cellulare dagli organoidi e dopo due o tre giorni, monitorare la coltura mitotica. Le cellule sono vicine alla confluenza reintegrando il mezzo ogni due o tre giorni. Piccoli pezzi del sistema vascolare possono attaccarsi e dare origine alla crescita delle cellule dei fibroblasti.

In caso di crescita significativa dei fibroblasti. Eseguire l'inciampinizzazione differenziale per rimuovere i fibroblasti dalle grandi chiazze epiteliali. Lavare le celle una volta nel tampone STE.

Quindi aggiungere 0,5 millilitri di STE freschi per coprire il piatto con un'osservazione microscopica continua e colpi delicati ma decisi del piatto contro una superficie dura. Cerca il distacco dei fibroblasti mentre le cellule epiteliali sono ancora in fase di passaggio aderente. Le colture primarie quando le chiazze di escrescenza epiteliale si avvicinano alla confluenza.

Per mantenere le impostazioni cultura primarie e generare più impostazioni cultura secondarie, utilizzare la tripsina parziale. Lavare le celle una volta nel tampone STE, quindi aggiungere STE fresco per coprire il piatto. Monitorare che circa il 50% delle cellule si sia staccato.

Quindi aggiungere due millilitri di siero contenente terreno di crescita e raccogliere le cellule. Quindi trasferire le cellule in una provetta sterile da 15 millilitri dopo due lavaggi. Raggruppare le cellule raccolte e la coltura La parzializzazione può essere ripetuta da quattro a otto volte con una buona ricrescita cellulare dalle piastre primarie e con una crescita equivalente a lungo termine dalla sottocoltura o dalle secondarie congelate.

Si consiglia di congelare le cellule della prima tripsinizzazione parziale per la conservazione e di utilizzare le cellule del secondo PT per la subcoltura. Quando il tessuto viene adeguatamente digerito e filtrato, si possono vedere organoidi che mostrano strutture duttali e alveolari con bordi lisci privi di stroma attaccato. Se sottodigerito, ci sarà materiale attaccato e più contaminazione da fibroblasti se eccessivamente digerito i bordi saranno ruvidi e l'attacco sarà meno efficiente dopo l'attacco dell'organoide.

La crescita epiteliale inizia entro 48-72 ore a 48 ore. Non c'è ancora divisione cellulare attiva con mitosi visibile entro 72 ore. La mitosi dovrebbe diventare più visibile.

Piccoli pezzi di vascolarizzazione possono essere una fonte di crescita delle cellule mesenchimali dopo quattro giorni. Le escrescenze epiteliali mostrano popolazioni morfologicamente eterogenee, qui colorate con anticorpi contro la cheratina 14 e la cheratina 19 contrassegna le linee mioepiteliali verdi K 19 positive luminali e rosse K 14 positive, e anche le cellule progenitrici gialle K 14 positive K 19. L'HMEC può essere coltivato in diverse formulazioni di terreni.

I terreni a basso stress come l'M 87 e l'integrazione con tossina del colera e ossitocina supportano una crescita superiore a lungo termine della normale prestasi HMEC, nonché la crescita di più lignaggi HMEC. I risultati dell'analisi dei fatti illustrano la diversità del lignaggio negli organoidi non coltivati e, nel quarto passaggio, HMEC coltivato in M 87, terreno A. Qui, le popolazioni luminali e mioepiteliali sono identificate mediante l'espressione di marcatori luminali, EPCA e CD 2 27 e marcatori mioepiteliali CD 49 F e CD 10 replated.

Quarto passaggio, HMEC. I fatti arricchiti per i precedenti marcatori luminali e mioepiteliali hanno il loro lignaggio confermato utilizzando analisi di immunofluorescenza per la cheratina K 14 e K 19 HMEC. Coltivati su plastica fino al passaggio quattro, sono in grado di formare strutture organizzate con relazioni di lignaggio in vivo di cellule luminali e mioepiteliali, quando vengono collocate in appropriati CD 2, 27 e CD 10 vengono utilizzate per arricchire questi due lignaggi.

Gli HMC mantengono la loro capacità di formare una corretta organizzazione cellulare 3D in micro pozzetti 3D micromodellati con cellule luminali all'interno delle cellule mioepiteliali. Le cellule progenitrici arricchite con fatti possono anche formare robuste strutture 3D quando vengono placcate in matrigel, imitando le strutture duttulari e alveolari. Le strutture 3D in Matrigel mostrano anche una corretta auto-organizzazione 3D.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come purificare le parti epiteliali della ghiandola mammaria libere dallo stroma mammario associato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita nel corso di due o tre giorni. La tecnica di lavorazione dei tessuti è generalmente semplice.

È importante ricordarsi di interrompere la digestione al punto corretto.