Name: Gradiente di densità multistrato polimerizzazione (DGMP): una tecnica innovativa per la creazione di comparti multipli, Ponteggi personalizzabili per lingegneria tissutale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Scopri la tecnica DGMP per creare ponteggi multistrato biocompatibili per l'ingegneria tissutale. Questo metodo economico permette di studiare la migrazione cellulare senza strumentazione costosa.

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Gli autori sono grati per il sostegno di premi NIH di regia Innovator Nuovi (1DP2 OD006499-01 AA e 1DP2 OD006460-01 a AJE), e King Abdulaziz City per la Scienza e la Tecnologia (UC San Diego Centro di Eccellenza in nanomedicina). Vorremmo ringraziare la signora Jessica Moore per i suoi commenti critici sul manoscritto.

1. Sintesi di marcato in modo fluorescente Acryloyl-PEG-Rgds <ol><li> Reagiscono con il peptide Rgds acriloil-PEG-succinimidil carbossimetil estere (APEG-SCM, PEG MW: 3400 g / mol) e NN diisopropiletilammina (DIPEA) a 1.2:1:2 rapporti molari in dimetilsolfossido (DMSO) sotto argon a temperatura ambiente durante la notte. </li><li> Confermare coniugazione da matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione tempo di volo (MALDI-TOF), spettrometria di massa. Aggiungere 1 ml di APEG-Rgds soluzione di reazione in un punto campione sul target MALDI e asciutto. Preparare una soluzione satura di universale MALDI Matrix in tetraidrofurano (THF) e vortex per 1 min. ~ Aggiungere 1 ml di questa soluzione a punto del campione stesso. Ripetere la procedura per APEG-SCM per il confronto. Caricare e analizzare. Il peso molecolare di APEG-Rgds dovrebbe essere maggiore di APEG-SCM (Figura 2). </li><li> Di coniugare il fluoroforo, aggiungere una quantità equimolare di Alexa Fluor 350 carbossilico (succinimydyl estere), discioltoin un volume minimo di DMSO, al APEG-Rgds soluzione di reazione da 1,1 e reagire sotto argon a temperatura ambiente per una notte. </li><li> Purificare APEG-Rgds-350 da dialisi (MW 3500 Da) contro il DI-H 2 O a 4 ° C per 48 ore a 1.000:1 rapporto volumetrico, lo scambio di dialisato almeno due volte al giorno. </li><li> Congelare asciugare la purificato APEG-Rgds-350 in Freezone Labconco Plus o Blocco del sistema equivalente a secco e conservare a -20 ° C. </li></ol> 2. Preparazione di uno stampo 2D e Realizzazione di un gel PEG 2D con alternata Rgds-350 Livelli <ol><li> Preparare vetrini idrofobiche. Posizionare vetrini puliti in un piatto di vetro in un forno a vuoto. Riscaldare a 80 ° C per 30 minuti per asciugare completamente le superfici. Luogo piatto con le diapositive in una cappa aspirante e aggiungere 250 microlitri Sigmacote a ogni diapositiva, delicatamente a dondolo per 30 sec alla superficie cappotto intero. Sciacquare i vetrini rivestiti con 100% metanolo, seguita da lavaggio con acqua distillata, ammollo due volte per 5 min in a least 10 ml. </li><li> Tagliare distanziali in silicone (0,8 mm di spessore) con 10 mm pugni biopsia. </li><li> Autoclave i distanziali in silicone e Sigmacote trattati con vetrini. </li><li> Formulare soluzioni per ciascun rispettivo strato in provette per microcentrifuga singoli mescolando PEG diacrilato (PEGda) precursore (concentrazione finale 15% w / v) con diverse quantità di iodixanolo (soluzione stock 60% in acqua) per produrre concentrazioni finali diverse (ad esempio il 40%, 30%, 20% e 10%), che completa il volume residuo di tampone fosfato (PBS) per ottenere soluzioni di densità differenziate. In modo simile, per strati alternati, mix APEG-Rgds-350 (concentrazione finale 8 mm) con iodixanolo e PBS per produrre concentrazioni diverse (ad esempio 35%, 25%, e 15%). </li><li> Aggiungi fotoiniziatore (2-idrossi-4&#39;-(2-idrossietossi)-2-metilpropiofenone, magazzino 333mg/ml in N-vinil pirrolidone) per ogni soluzione per vari strati (10 pl di soluzione madre per ml di ciascuna soluzione di strato). Fotoiniziatore is ultimo aggiunto per prevenire la polimerizzazione prima stratificazione dei gel nello stampo, in quanto è sensibile alla luce. </li><li> I passi successivi di questo protocollo sarà effettuata in un armadio biosicurezza per garantire la sterilità. </li><li> Filtro-sterilizzare ogni soluzione sterile utilizzando una siringa da 1 ml e 0,2 micron. Assemblare l&#39;impostazione stampo intramezzando il distanziatore tra due Sigmacore trattati vetrini e sicure con fascette ponendo come illustrato in Figura 1. </li><li> Gettare i gel strati aggiungendo la soluzione più densa (es. PEGda con il 40% iodixanolo) prima, seguita da una soluzione meno densa (es APEG-Rgds-350 con 35% iodixanolo). Ripetere la stratificazione alternate per ottenere diversi strati di composizione desiderata e densità come mostrato in Figura 1. </li><li> Irradiare lo stampo con la luce 365 nm per 3 minuti con un portatile UVR-9000 lampada. Consentire i gel polimerizzati per curare per 5 min. Rimuovere i morsetti, quindi sollevare delicatamente il vetro superiorediapositiva e lo stampo, i gel DGMP stratificate rimarrà nelle diapositive. Utilizzando una spatola sterile, posizionare accuratamente il gel in una provetta da 50 ml contenente PBS sterile o mezzo di coltura per il lavaggio. </li><li> Lavare il gel polimerizzato in PBS a 1.000:1 rapporto volumetrico, lo scambio di buffer di almeno due volte al giorno per rimuovere il modificatore densità, fotoiniziatore, e polimero che non ha reagito. In alternativa, PBS può essere scambiato con il terreno di crescita. Conservare i gel DGMP in PBS o terreno di coltura per l&#39;esperimento di coltura cellulare indicato al punto 3. </li><li> Per visualizzare strati alternati, organizzare gel DGMP (questi gel non saranno utilizzabili per colture cellulari) lungo un righello sul vassoio campione del meccanismo di documentazione gel VersaDoc. Esporre i gel a 350 nm, il tempo di esposizione varia a seconda della concentrazione del fluoroforo. Alternando bande scure e blu nell&#39;idrogel DGMP dimostrano formazione di strati distinti di composizione chimica diversa (Figura 3). </li></ol><ol><li> Per i gel che incorporano peptide Rgds, usare le cellule di adesione dipendenti, ad esempio mioblasti C2C12. </li><li> Inserire delicatamente gel DGMP (memorizzati in PBS) nei pozzetti di piastre di coltura cellulare a 48 pozzetti utilizzando un raschietto sterile cella in un armadio biosicurezza. </li><li> Pre-riscaldare terreno di crescita (terreno Eagle modificato da Dulbecco o DMEM supplementato con 10% v / v di siero fetale bovino e 1% v / v 100x soluzione di penicillina-streptomicina) e PBS in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Lavare una piastra 60% confluenti (10 mm) di C2C12 tre volte con PBS. Aspirare off PBS e cellule raccolto aggiungendo 1 ml di 0,25% tripsina-EDTA e incubando a 37 ° C per 2 min. Risospendere le cellule in mezzo di crescita e cellule di conteggio. Il seme DGMP gel-coltura cellulare contenente bene con mioblasti C2C12 (20.000 cellule / cm 2). Incubare le cellule a 37 ° C in 5% CO 2/95% di umidità relativa. Delicatamente mezzo di scambio, dopo 4 ore, fare attenzione a non rispostare leggermente cellule aderenti. </li><li> Dopo 24 ore, il sequestro conservativo di mioblasti C2C12 sui Rgds contenenti strati di gel DGMP può essere confermata da epifluorescenza e microscopia a contrasto di fase (Zeiss Axiovert 200). </li></ol>

<ol><li>Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+in+biomaterials+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Complexity in biomaterials for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).</li>
<li>Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein+and+cell+adhesivity+using+PEO-terminated+triblock+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers.</a> J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).</li>
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<li>Hahn, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographic+patterning+of+polyethylene+glycol+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photolithographic patterning of polyethylene glycol hydrogels.</a> Biomaterials. 27, 2519-2524 (2006).</li>
<li>Kizilel, S., Sawardecker, E., Teymour, F., Perez-Luna, V. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+formation+of+covalently+bonded+hydrogel+multilayers+through+surface+initiated+photopolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Sequential formation of covalently bonded hydrogel multilayers through surface initiated photopolymerization.</a> Biomaterials. 27, 1209-1215 (2006).</li>
<li>Harley, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+multiphase+osteochondral+scaffold.+II.+Fabrication+of+a+mineralized+collagen-glycosaminoglycan+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Design of a multiphase osteochondral scaffold. II. Fabrication of a mineralized collagen-glycosaminoglycan scaffold.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 92, 1066-1077 (2010).</li>
<li>Cuchiara, M. P., Allen, A. C., Chen, T. M., Miller, J. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+microfluidic+PEGDA+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Multilayer microfluidic PEGDA hydrogels.</a> Biomaterials. 31, 5491-5497 (2010).</li>
<li>Roam, J. L., Xu, H., Nguyen, P. K., Elbert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+formation+of+protein+concentration+gradients+mediated+by+density+differences+of+poly%28ethylene+glycol%29+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The formation of protein concentration gradients mediated by density differences of poly(ethylene glycol) microspheres.</a> Biomaterials. 31, 8642-8650 (2010).</li>
<li>Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Cabodi, M., Stroock, A. D., Bonassar, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+properties+of+laminated+alginate+gels+for+tissue+engineering+of+layered+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res.+A%22%5BJournal%5D)">Adhesive properties of laminated alginate gels for tissue engineering of layered structures.</a> J. Biomed. Mater. Res. A. 85, 611-618 (2008).</li>
<li>Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+gradient+multilayer+polymerization+for+creating+complex+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue.</a> Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).</li>
<li>Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+attachment+activity+of+fibronectin+can+be+duplicated+by+small+synthetic+fragments+of+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule.</a> Nature. 309, 30-33 (1984).</li>
<li>Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+Situ+Mechanical+Analysis+of+Myofibrillar+Perturbation+and+Aging+on+Soft%2C+Bilayered+Drosophila+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)"> In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium.</a> Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

DGMP è una semplice strategia per la preparazione di gel multistrato che non si basano su strumenti costosi. Questo protocollo può essere adattato per creare ponteggi utilizzano altri materiali biocompatibili, quali collagene e acido ialuronico. Piccole molecole bioattive, per esempio cellule promotore di adesione peptide Rgds, possono essere legati alla matrice polimerica per evitare miscelazione di segnali tra gli strati. Proteine ​​possono essere incapsulati in strati distinti senza la necessità di coniugazione chimica come, a seconda della dimensione delle maglie della matrice, sono meno inclini a diffondere attraverso idrogel 10. Qui abbiamo usato iodixanolo (Nycoprep), un modificatore densità inerte, che è stato precedentemente utilizzato per applicazioni di cellule vitali. Modificatori densità altre come saccarosio e destrosio può anche essere usato. Variando il tempo di assestamento (t s), è possibile mettere a punto le interfacce tra i due strati per produrre transizioni morbide o taglienti, se necessario (tempo più lungo assestamento dà transizioni più uniformi) &lt;sup&gt; 10. Per esempio, fluide transizioni tra strati di gel DGMP potrebbe essere utilizzato per generare un gradiente continuo di una stecca biologica per studiare processi cellulari come chemiotassi. L&#39;effetto del modificatore densità sulla rigidità gel è mostrato in Figura 5 per un 15% aPEGda gel; una caratterizzazione più completa di rigidità e di porosità in funzione della concentrazione e PEGda iodixanolo attualmente è sottoposto. Mentre la concentrazione PEGda in questo esempio è relativamente elevato, abbiamo osservato un modulo elastico maggiore del 60% in gel con il 30% rispetto al iodixanolo senza gel. La variazione rigidità gel può essere regolata per modulando la concentrazione macromero o densità di reticolazione. Abbiamo anche applicato la tecnica DGMP creare 3D multistrato utilizzando gel di poliacrilammide e precursori PEG 10. Variando la concentrazione e il grado di reticolazione del prepolimero consente variazione strutturaleponteggi, che possono essere usati per esplorare il comportamento cellulare come la crescita e la migrazione polarizzata in 3D. In sintesi, DGMP è una tecnica adattabile che può essere applicato a fabbricare scaffold 2D e 3D da una varietà di materiali biocompatibili per un&#39;ampia gamma di applicazioni di ricerca biomedica e di base.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reagente o dello strumento </td><td> Azienda </td><td> Numero di catalogo </td></tr><tr><td> Polietilene glicole succinimydyl carbossimetil (a-PEG-SCM) </td><td> Laysan </td><td> 120-64 </td></tr><tr><td> Polyethelyene glicol diacrilato (PEGda) </td><td> Dajac Labs </td><td> 9359 </td></tr><tr><td> Arginina-Glicina-Acido aspartico-serina (Rgds) </td><td> American Peptide </td><td> 49-01-4 </td></tr><tr><td> N, N - Diisopropiletilammina (DIPEA) </td><td> Sigma </td><td> D125806 </td></tr><tr><td> Dimetilsolfossido (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2438 </td></tr><tr><td> N, N-dimetilformammide (DMF) </td><td> Pescatore </td><td> D119-4 </td></tr><tr><td> Tetraidrofurano (THF) </td><td> Pescatore </td><td> T397 </td></tr><tr><td> Dialisi cassetta (3500Da) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66330 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 350 carbossilico succinimydyl </td><td> Life Technologies </td><td> A-10.168 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma </td><td> SL2 </td></tr><tr><td> Distanziali in silicone </td><td> Grainger </td><td> 1MWA4 </td></tr><tr><td> Biopsia pugni </td><td> Acuderm </td><td> P1025 (10 mm) P850 (8 mm) </td></tr><tr><td> Fosfato di Dulbecco tamponata salina (DPBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30028 </td></tr><tr><td> Iodixanolo (NycoPrep) </td><td> Pescatore </td><td> NC9388846 </td></tr><tr><td> 2-idrossi-4&#39;-(2-idrossietossi)-2-metilpropiofenone </td><td> Sigma </td><td> 410896 </td></tr><tr><td> Mezzo di Dulbecco Eagle modificato (DMEM) </td><td> Life Technologies </td><td> 11054 </td></tr><tr><td> Siero fetale bovino </td><td> Life Technologies </td><td> 10082 </td></tr><tr><td> Penicillina-streptomicina </td><td> Life Technologies </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> Mioblasti C2C12 </td><td> ATCC </td><td> CRL-1772 </td></tr><tr><td> MALDI </td><td> Bruker </td><td> N / A </td></tr><tr><td> UVR-9000 </td><td> Bayco </td><td> UVR-9000 </td></tr><tr><td> VersaDoc </td><td> Bio-Rad </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

gradiente di densità multistrato polimerizzazione (dgmp): una tecnica innovativa per la creazione di comparti multipli, ponteggi personalizzabili per l&#39;ingegneria tissutale

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complesse matrici di coltura di tessuti, in cui tipi e concentrazioni di stimoli biologici (ad esempio fattori di crescita, inibitori, o piccole molecole) o struttura a matrice (ad esempio composizione, concentrazione, o rigidità della matrice) variano nello spazio, consentirebbe un&#39;ampia gamma di indagini riguardo a come queste variabili influenzano la differenziazione cellulare, la migrazione, e altri fenomeni. La sfida principale nella creazione di matrici stratificate è mantenere l&#39;integrità strutturale di interfacce strato senza diffusione di singoli componenti da ogni strato 1. Attuali metodologie questo comporta in particolare photopatterning 2-3, litografia 4, functionalization5 sequenziale, liofilizzazione 6, microfluidica 7, 8 o centrifugazione, molti dei quali richiedono strumentazione sofisticata e competenze tecniche. Altri tramite attacco sequenziale dei singoli strati, che può portare alla delaminazione degli strati 9 </sup&gt;. DGMP supera questi problemi utilizzando un modificatore inerte densità come iodixanolo per creare strati di diversa densità 10. Poiché il modificatore densità può essere miscelato con qualsiasi prepolimero o molecola bioattiva, DGMP permette ogni strato scaffold da personalizzare. Semplicemente variando la concentrazione del modificatore densità impedisce miscelazione degli strati adiacenti, mentre rimangono acquosa. Successiva polimerizzazione passo comporta una strutturalmente continua scaffold multistrato, in cui ogni strato ha chimico distinto e proprietà meccaniche. Il modificatore di densità può essere facilmente rimosso con risciacquo sufficiente senza perturbazione dei singoli strati o loro componenti. Questa tecnica è particolarmente indicato per la creazione di idrogel di varie dimensioni, forme e materiali. Un protocollo per la fabbricazione di una 2D-polietilene glicole (PEG) gel, in cui strati alternati incorporano Rgds-350, è descritto di seguito. Usiamo PEG because è biocompatibile e inerte. Rgds, un peptide adesione cellulare 11, è utilizzato per dimostrare restrizione spaziale di una stecca biologica, e la coniugazione di un fluoroforo (Alexa Fluor 350) permette di distinguere visivamente vari strati. Questa procedura può essere adattato per altri materiali (ad esempio collagene, acido ialuronico, ecc) e può essere esteso per fabbricare gel 3D con alcune modifiche 10.

MALDI-TOF analisi conferma la coniugazione del peptide ad Rgds acriloil-PEG (Figura 2). Gel di imaging rivela alternata Rgds-350 (blu) dopo la fotopolimerizzazione strati (Figura 3A). Come mostrato in Figura 3A, 2D gel DGMP dimensioni possono variare in base al diametro degli stampi in silicone (10 mm, sinistra, 8 mm, a destra), e pertanto sono facilmente personalizzabile per uso in saggi multipli - in questo caso per adattarsi a 48 pozzetti di piastra di cella (Figura 3B). Epifluorescenza e microscopio a contrasto di fase di mioblasti C2C12 coltivate su un gel DGMP mostra attacco selettivo Rgds-350-strati contenenti PEG (Figura 4), ​​dimostrando compartimentalizzazione del peptide adesione cellulare (Rgds). <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1highres.jpg"/> Figura 1. Molecolare Weight analisi mediante MALDI-TOF confronto APEG-SCM-APEG Rgds ottenuti dopo la coniugazione del peptide Rgds. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2highres.jpg"/> Figura 2. Rappresentazione schematica di fabbricazione DGMP gel. Dopo i gradienti sono stratificati, possono essere autorizzati a stabilirsi per periodi di tempo variabili (t s) per creare interfacce laureati, seguita da fotopolimerizzazione. Stratificati DGMP gel può essere facilmente estratto dallo stampo per un ulteriore uso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50018/50018fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. A) gel 2D multistrato ottenuti dopo la fotopolimerizzazione ripreso con 350 nm e canali bianchi leggeri di VersaDoc gel documentazione della trasmissione. La scala di grigi rivela strati alternati contenenti Rgds in bianco. B) Inserimento di gel DGMP in piatti cellulari a 48 pozzetti. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Contrasto di fase e l&#39;immagine unita ad epifluorescenza di mioblasti C2C12 coltivate su DGMP gel (scala bar 50 micron). <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Effetto della iodixanolo sull&#39;elasticità gel superficie. Atomic microscopia misure di forza di campioni statici di substrati PEG reticolati con metodi stabiliti in precedenza con un trigger 2 nN forza 12. * P &lt;0,05 e ** p &lt;0,01.

Qui si descrive una strategia unica per la creazione di matrici biocompatibili, stratificate con interfacce continui tra strati distinti per l&#39;ingegneria tissutale. Tale scaffold in grado di fornire un ambiente ideale personalizzabile per modulare il comportamento cellulare da vari segnali biologici, chimici o meccanici

Gradiente di densità multistrato polimerizzazione (DGMP): una tecnica innovativa per la creazione di comparti multipli, Ponteggi personalizzabili per l&#39;ingegneria tissutale

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un'impalcatura di coltura cellulare multistrato. Questo video mostrerà come produrre una matrice di coltura cellulare 2D, incorporando il peptide di adesione RGDS in strati alternati per separare le regioni delle cellule C due C 12. Ciò si ottiene legando prima il peptide RGDS a una macro fedele acro.La combinazione di macro peptidi viene quindi etichettata con il colorante LOR per consentire la visualizzazione del peptide contenente strati di gel multistrato. Il secondo passo consiste nel formare gli stampi tagliandoli da un foglio di silicone e inserendoli tra due vetrini dopo la prem, mescolando i singoli componenti di ogni strato. Soluzioni di peg di acrl e peg di acrl con PEG RGDS Alexa three 50 sono alternativamente stratificate all'interno degli stampi.I gel sono polimerizzati mediante irradiazione UV. Il passaggio finale consiste nel seminare due cellule C 12 su gel multistrato 2D per esaminare come la composizione della matrice influisce sulla crescita e l'adesione delle cellule. Infine, la microscopia a campo chiaro e a fluorescenza viene utilizzata per visualizzare la crescita selettiva di cellule C 2 C 12 sugli scaffold.Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che si tratta di un metodo semplice ed economico per la creazione di matrici di colture cellulari 2D e 3D multistrato. Non si basa sulla necessità di strumentazione costosa. Mentre le interfacce tra i livelli sono contigue e strutturalmente integrali.Non c'è miscelazione tra i componenti dei singoli strati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave, come il modo in cui le cellule migrano e si polarizzano in risposta a segnali biologici, chimici e meccanici modellati. Questo metodo può fornire una visione delicata della migrazione e della differenziazione cellulare e può essere applicato ad altri sistemi, come la direzione di una nuova crescita destra e la sinaptogenesi delle cellule staminali neuronali.Per iniziare questa procedura, combinare il peptide RGDS e l'estere metilmetilico del succinilcarbo dell'olio di acro in un rapporto molare di uno a due a uno in DMSO secco sotto Argonne. Quindi aggiungere NN diop, propil metilammina o D-I-P-E-A a un rapporto molare di due a uno rispetto all'aquilo PEG SCM per facilitare la reazione, confermare la coniugazione della molecola di aquilo PEG RGDS utilizzando la spettrometria di massa TOF ammuffita. Per questo separatamente, aggiungere un microlitro della soluzione di reazione AQUILO PEG RGDS e un microlitro di aquilo PEG SCM non reattivo in diversi punti del bersaglio ammuffito.Lasciali asciugare entrambi. Quindi preparare una soluzione satura di matrice ammuffita universale in vortice THF per un minuto e aggiungere un microlitro negli stessi due punti. Lasciali asciugare entrambi.Quindi, caricare i campioni. Esegui analisi di muffe dure con un laser a 60 hertz a circa il 19% di potenza utilizzando gli algoritmi SAVIS gole smoothing, sottrazione della linea di base e rilevamento del picco OID. Il peso molecolare dell'acro PEG RGDS deve essere spostato verso destra, in corrispondenza della variazione di massa dovuta al peptide legato covalentemente.Il passo successivo consiste nel coniugare il Fluor aggiungendo una quantità equimolare di LOR tre acido carbossilico 50 aspira un estere midal relativo all'aquilo PEG SCM disciolto in un volume minimo di DMSO alla soluzione di reazione aquilo PEG RGDS Sotto argon incubare per una notte a temperatura ambiente. Quindi purificare il peg di olio acro RGD S3 50 dializzando contro l'acqua colorante a quattro gradi Celsius utilizzando una cassetta per dialisi con cutoff di peso molecolare 3.500 DAU. Continuare la dialisi per 48 ore utilizzando un rapporto volumetrico 1001, sostituendo il dialisato freddo almeno due volte al giorno.Il prodotto viene ulteriormente purificato mediante sterilizzazione con filtro a siringa da 0,22 micron. Infine, in un ambiente sterile, aliquotare l'olio di acro sterile purificato peg RGD S3 50 in provette sterili pre-pesate per microcentrifuga. Sigillare le provette aperte per microcentrifuga all'interno del tubo di sfiato sterile.I campioni sono stati liofilizzati e conservati sigillati con una pellicola di paraffina a meno 20 gradi Celsius. Pre-lavare i vetrini in metanolo al 100% e asciugare in forno a 80 gradi Celsius fino a quando il liquido evapora. Quindi posizionare una capsula contenente i vetrini in una cappa aspirante e aggiungere 250 microlitri di sigma coat a ciascun vetrino.Scuotere delicatamente i vetrini per 30 secondi in modo da ricoprire l'intera superficie. Successivamente, sciacquare accuratamente i vetrini rivestiti con metanolo al 100%, seguito da lavaggio e acqua distillata, immergendoli due volte per cinque minuti in almeno 10 millilitri di acqua. Una volta risciacquati, lasciare asciugare i vetrini all'aria.Preparare spazi di silicone spessi 0,8 millimetri tagliando un foglio di silicone delle stesse dimensioni dei vetrini. Quindi, utilizzando punzoni per biopsia, praticare fori da 10 o otto millimetri nel silicone per tenere le impalcature usando una lama di rasoio. Crea dei canali di circa due millimetri nella parte superiore dello stampo per consentire l'aggiunta del materiale dell'impalcatura.Quindi sterilizzare in autoclave gli spazi in silicone e rivestire sigma i vetrini trattati per sterilizzarli. Sterilizzare anche materiali aggiuntivi per la colata dei gel, come tubi einor e pinze. In una cappa di coltura tissutale, sterilizzare una soluzione madre di Peg di aquil utilizzando una siringa sterile da un millilitro e un filtro da 0,2 micron.Iniziare formulando soluzioni prepolimeriche PEG con un rapporto peso/volume del 15% per ciascun rispettivo strato in singole provette di micro rifiuti ambrate combinando il 50% di PEG D acrl con diverse quantità di soluzione madre sterile 60% IO DAL PBS e fotoiniziatore per produrre concentrazioni finali variabili di 10%20%30% e 40%I oal mescolare accuratamente le soluzioni per preparare la soluzione prepolimerica PEG al 15% marcata in fluorescenza, combinare il 50% di PEG di aquil e aquilo PEG RGD S3 50 a una concentrazione finale di otto millimolari con la soluzione madre IO Dal, PBS e il fotoiniziatore in provette ambrate Microview per ottenere concentrazioni del 15%25% e del 35%IO IAL, mescolare accuratamente le soluzioni. Successivamente, assemblare lo stampo posizionato un distanziatore pretagliato tra due vetrini in vetro trattato sigma co e fissarlo con morsetti. Una volta assemblato lo stampo, colare un gel stratificato aggiungendo prima 10 microlitri della soluzione al 40%, seguiti da 10 microlitri della soluzione al 35% marcata in modo fluorescente.Ripeti la stratificazione alternata per ottenere diversi strati. Quindi, irradiare lo stampo con luce a 365 nanometri per tre minuti. Utilizzando una lampada UVR 9.000 portatile, lasciare indurire gli idrogel polimerizzati per cinque minuti.Quindi rimuovere i morsetti e sollevare delicatamente il vetrino superiore e lo stampo. Il gradiente di densità stratificato. I gel di polimerizzazione multi-laid o DG MP rimarranno sui vetrini.Utilizzando una spatola sterile, rimuovere con cura i gel dallo stampo e inserirli in una provetta da 50 millilitri contenente DMEM sterile. Lavare i gel polimerizzati utilizzando un rapporto volumetrico di DMEM di 1000 a uno per 48 ore con due sostituzioni di tampone al giorno. Questo rimuoverà qualsiasi densità, modificatore, fotoiniziatore e pre polimero di reazione.Quindi conservare i gel DGMP in DMEM integrati con streptomicina all'1% di penicillina. Per visualizzare gli strati alternati, disporre il gel DGMP lungo un righello sul vassoio del campione di un'unità di documentazione del gel. Quindi esponi e visualizza i gel utilizzando Alexa tre 50 bande scure e blu alternate nell'idrogel DGMP dimostrano la formazione di strati discreti di composizione chimica distinta.Per preparare i gel DGMP per la coltura cellulare, inserirli delicatamente nei pozzetti di una piastra per coltura cellulare a 48 pozzetti. Utilizzando un raschietto cellulare sterile e sciacquandoli tre volte nel terreno di coltura cellulare. Successivamente, raccogliere i mioblasti C due C 12 da una piastra di coltura cellulare da 100 millimetri quando sono confluenti al 60%.Per fare ciò, sciacquare la piastra tre volte con PBS preriscaldato. Quindi aggiungere un millilitro di 0,25% di viaggi in EDTA e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per due minuti. Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere un millilitro di terreno di coltura preriscaldato e trasferire le cellule in una provetta conica da 50 millilitri per la centrifugazione.Dopo che le cellule sono state pellettate Reeses, metterle in un terreno di coltura e contare le cellule vive aggiungendo triam blue e utilizzando un contatore di cellule TC 10. Quindi seminare l'impalcatura DG MP con mioblasti C 2 C 12 e incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Confermare l'attacco di due mioblasti C 12 sull'RGDS contenente strati di gel DGMP utilizzando la microscopia a epifluorescenza e a contrasto di fase.Gli strati alternati di gel DGMP possono contenere vari peptidi come RGDS mostrato a destra, che supporta l'attaccamento e la crescita cellulare. Lo strato a sinistra, tuttavia, non conteneva alcun peptide di attaccamento cellulare e le cellule non sono sopravvissute in quella regione. IO diolo può influenzare la rigidità del gel.Qui, il modulo elastico è stato misurato utilizzando la microscopia a forza atomica. Un aumento del 60% della rigidità è stato osservato quando si utilizza il 30% di IAL in questa formulazione di gel, l'effetto IAL sulla rigidità del gel può variare in base ai materiali utilizzati Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare la sequenza degli strati. Il livello contenente la quantità più alta di IEX null sarà in basso, mentre il livello con la minor quantità di IEX null sarà in alto.Ricordarsi sempre di aggiungere il fotoiniziatore alla fine per evitare la polimerizzazione dalla luce ambientale. Con i nostri collaboratori, stiamo adattando questa tecnica per organizzare la crescita dei neuriti in 3D. Ciò consentirà di confrontare le cellule neuroprogenitrici derivate da individui sani e quelle di pazienti con disturbi dello sviluppo neurologico.Non dimenticare che lavorare con la luce ultravioletta può essere pericoloso. Indossare occhiali protettivi dai raggi UV durante l'esecuzione della fase di reticolazione.

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Gradiente di densità multistrato polimerizzazione (DGMP): una tecnica innovativa per la creazione di comparti multipli, Ponteggi personalizzabili per lingegneria tissutale (Video) | JoVE Journal

Gradiente di densità multistrato polimerizzazione (DGMP): una tecnica innovativa per la creazione di comparti multipli, Ponteggi personalizzabili per l'ingegneria tissutale

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