Gradiente di densità multistrato polimerizzazione (DGMP): una tecnica innovativa per la creazione di comparti multipli, Ponteggi personalizzabili per l'ingegneria tissutale

L'obiettivo generale di questa procedura è creare un'impalcatura di coltura cellulare multistrato. Questo video mostrerà come produrre una matrice di coltura cellulare 2D, incorporando il peptide di adesione RGDS in strati alternati per separare le regioni delle cellule C due C 12. Ciò si ottiene legando prima il peptide RGDS a una macro fedele acro.

La combinazione di macro peptidi viene quindi etichettata con il colorante LOR per consentire la visualizzazione del peptide contenente strati di gel multistrato. Il secondo passo consiste nel formare gli stampi tagliandoli da un foglio di silicone e inserendoli tra due vetrini dopo la prem, mescolando i singoli componenti di ogni strato. Soluzioni di peg di acrl e peg di acrl con PEG RGDS Alexa three 50 sono alternativamente stratificate all'interno degli stampi.

I gel sono polimerizzati mediante irradiazione UV. Il passaggio finale consiste nel seminare due cellule C 12 su gel multistrato 2D per esaminare come la composizione della matrice influisce sulla crescita e l'adesione delle cellule. Infine, la microscopia a campo chiaro e a fluorescenza viene utilizzata per visualizzare la crescita selettiva di cellule C 2 C 12 sugli scaffold.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti è che si tratta di un metodo semplice ed economico per la creazione di matrici di colture cellulari 2D e 3D multistrato. Non si basa sulla necessità di strumentazione costosa. Mentre le interfacce tra i livelli sono contigue e strutturalmente integrali.

Non c'è miscelazione tra i componenti dei singoli strati. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave, come il modo in cui le cellule migrano e si polarizzano in risposta a segnali biologici, chimici e meccanici modellati. Questo metodo può fornire una visione delicata della migrazione e della differenziazione cellulare e può essere applicato ad altri sistemi, come la direzione di una nuova crescita destra e la sinaptogenesi delle cellule staminali neuronali.

Per iniziare questa procedura, combinare il peptide RGDS e l'estere metilmetilico del succinilcarbo dell'olio di acro in un rapporto molare di uno a due a uno in DMSO secco sotto Argonne. Quindi aggiungere NN diop, propil metilammina o D-I-P-E-A a un rapporto molare di due a uno rispetto all'aquilo PEG SCM per facilitare la reazione, confermare la coniugazione della molecola di aquilo PEG RGDS utilizzando la spettrometria di massa TOF ammuffita. Per questo separatamente, aggiungere un microlitro della soluzione di reazione AQUILO PEG RGDS e un microlitro di aquilo PEG SCM non reattivo in diversi punti del bersaglio ammuffito.

Lasciali asciugare entrambi. Quindi preparare una soluzione satura di matrice ammuffita universale in vortice THF per un minuto e aggiungere un microlitro negli stessi due punti. Lasciali asciugare entrambi.

Quindi, caricare i campioni. Esegui analisi di muffe dure con un laser a 60 hertz a circa il 19% di potenza utilizzando gli algoritmi SAVIS gole smoothing, sottrazione della linea di base e rilevamento del picco OID. Il peso molecolare dell'acro PEG RGDS deve essere spostato verso destra, in corrispondenza della variazione di massa dovuta al peptide legato covalentemente.

Il passo successivo consiste nel coniugare il Fluor aggiungendo una quantità equimolare di LOR tre acido carbossilico 50 aspira un estere midal relativo all'aquilo PEG SCM disciolto in un volume minimo di DMSO alla soluzione di reazione aquilo PEG RGDS Sotto argon incubare per una notte a temperatura ambiente. Quindi purificare il peg di olio acro RGD S3 50 dializzando contro l'acqua colorante a quattro gradi Celsius utilizzando una cassetta per dialisi con cutoff di peso molecolare 3.500 DAU. Continuare la dialisi per 48 ore utilizzando un rapporto volumetrico 1001, sostituendo il dialisato freddo almeno due volte al giorno.

Il prodotto viene ulteriormente purificato mediante sterilizzazione con filtro a siringa da 0,22 micron. Infine, in un ambiente sterile, aliquotare l'olio di acro sterile purificato peg RGD S3 50 in provette sterili pre-pesate per microcentrifuga. Sigillare le provette aperte per microcentrifuga all'interno del tubo di sfiato sterile.

I campioni sono stati liofilizzati e conservati sigillati con una pellicola di paraffina a meno 20 gradi Celsius. Pre-lavare i vetrini in metanolo al 100% e asciugare in forno a 80 gradi Celsius fino a quando il liquido evapora. Quindi posizionare una capsula contenente i vetrini in una cappa aspirante e aggiungere 250 microlitri di sigma coat a ciascun vetrino.

Scuotere delicatamente i vetrini per 30 secondi in modo da ricoprire l'intera superficie. Successivamente, sciacquare accuratamente i vetrini rivestiti con metanolo al 100%, seguito da lavaggio e acqua distillata, immergendoli due volte per cinque minuti in almeno 10 millilitri di acqua. Una volta risciacquati, lasciare asciugare i vetrini all'aria.

Preparare spazi di silicone spessi 0,8 millimetri tagliando un foglio di silicone delle stesse dimensioni dei vetrini. Quindi, utilizzando punzoni per biopsia, praticare fori da 10 o otto millimetri nel silicone per tenere le impalcature usando una lama di rasoio. Crea dei canali di circa due millimetri nella parte superiore dello stampo per consentire l'aggiunta del materiale dell'impalcatura.

Quindi sterilizzare in autoclave gli spazi in silicone e rivestire sigma i vetrini trattati per sterilizzarli. Sterilizzare anche materiali aggiuntivi per la colata dei gel, come tubi einor e pinze. In una cappa di coltura tissutale, sterilizzare una soluzione madre di Peg di aquil utilizzando una siringa sterile da un millilitro e un filtro da 0,2 micron.

Iniziare formulando soluzioni prepolimeriche PEG con un rapporto peso/volume del 15% per ciascun rispettivo strato in singole provette di micro rifiuti ambrate combinando il 50% di PEG D acrl con diverse quantità di soluzione madre sterile 60% IO DAL PBS e fotoiniziatore per produrre concentrazioni finali variabili di 10%20%30% e 40%I oal mescolare accuratamente le soluzioni per preparare la soluzione prepolimerica PEG al 15% marcata in fluorescenza, combinare il 50% di PEG di aquil e aquilo PEG RGD S3 50 a una concentrazione finale di otto millimolari con la soluzione madre IO Dal, PBS e il fotoiniziatore in provette ambrate Microview per ottenere concentrazioni del 15%25% e del 35%IO IAL, mescolare accuratamente le soluzioni. Successivamente, assemblare lo stampo posizionato un distanziatore pretagliato tra due vetrini in vetro trattato sigma co e fissarlo con morsetti. Una volta assemblato lo stampo, colare un gel stratificato aggiungendo prima 10 microlitri della soluzione al 40%, seguiti da 10 microlitri della soluzione al 35% marcata in modo fluorescente.

Ripeti la stratificazione alternata per ottenere diversi strati. Quindi, irradiare lo stampo con luce a 365 nanometri per tre minuti. Utilizzando una lampada UVR 9.000 portatile, lasciare indurire gli idrogel polimerizzati per cinque minuti.

Quindi rimuovere i morsetti e sollevare delicatamente il vetrino superiore e lo stampo. Il gradiente di densità stratificato. I gel di polimerizzazione multi-laid o DG MP rimarranno sui vetrini.

Utilizzando una spatola sterile, rimuovere con cura i gel dallo stampo e inserirli in una provetta da 50 millilitri contenente DMEM sterile. Lavare i gel polimerizzati utilizzando un rapporto volumetrico di DMEM di 1000 a uno per 48 ore con due sostituzioni di tampone al giorno. Questo rimuoverà qualsiasi densità, modificatore, fotoiniziatore e pre polimero di reazione.

Quindi conservare i gel DGMP in DMEM integrati con streptomicina all'1% di penicillina. Per visualizzare gli strati alternati, disporre il gel DGMP lungo un righello sul vassoio del campione di un'unità di documentazione del gel. Quindi esponi e visualizza i gel utilizzando Alexa tre 50 bande scure e blu alternate nell'idrogel DGMP dimostrano la formazione di strati discreti di composizione chimica distinta.

Per preparare i gel DGMP per la coltura cellulare, inserirli delicatamente nei pozzetti di una piastra per coltura cellulare a 48 pozzetti. Utilizzando un raschietto cellulare sterile e sciacquandoli tre volte nel terreno di coltura cellulare. Successivamente, raccogliere i mioblasti C due C 12 da una piastra di coltura cellulare da 100 millimetri quando sono confluenti al 60%.

Per fare ciò, sciacquare la piastra tre volte con PBS preriscaldato. Quindi aggiungere un millilitro di 0,25% di viaggi in EDTA e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per due minuti. Una volta che le cellule si sono staccate, aggiungere un millilitro di terreno di coltura preriscaldato e trasferire le cellule in una provetta conica da 50 millilitri per la centrifugazione.

Dopo che le cellule sono state pellettate Reeses, metterle in un terreno di coltura e contare le cellule vive aggiungendo triam blue e utilizzando un contatore di cellule TC 10. Quindi seminare l'impalcatura DG MP con mioblasti C 2 C 12 e incubare per 24 ore a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Confermare l'attacco di due mioblasti C 12 sull'RGDS contenente strati di gel DGMP utilizzando la microscopia a epifluorescenza e a contrasto di fase.

Gli strati alternati di gel DGMP possono contenere vari peptidi come RGDS mostrato a destra, che supporta l'attaccamento e la crescita cellulare. Lo strato a sinistra, tuttavia, non conteneva alcun peptide di attaccamento cellulare e le cellule non sono sopravvissute in quella regione. IO diolo può influenzare la rigidità del gel.

Qui, il modulo elastico è stato misurato utilizzando la microscopia a forza atomica. Un aumento del 60% della rigidità è stato osservato quando si utilizza il 30% di IAL in questa formulazione di gel, l'effetto IAL sulla rigidità del gel può variare in base ai materiali utilizzati Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare la sequenza degli strati. Il livello contenente la quantità più alta di IEX null sarà in basso, mentre il livello con la minor quantità di IEX null sarà in alto.

Ricordarsi sempre di aggiungere il fotoiniziatore alla fine per evitare la polimerizzazione dalla luce ambientale. Con i nostri collaboratori, stiamo adattando questa tecnica per organizzare la crescita dei neuriti in 3D. Ciò consentirà di confrontare le cellule neuroprogenitrici derivate da individui sani e quelle di pazienti con disturbi dello sviluppo neurologico.

Non dimenticare che lavorare con la luce ultravioletta può essere pericoloso. Indossare occhiali protettivi dai raggi UV durante l'esecuzione della fase di reticolazione.