Costruzione di fogli modulare idrogel per micropatterned macro-scala 3D Cellular Architettura

L'obiettivo generale di questa procedura è dimostrare la semplice fabbricazione, manipolazione e assemblaggio di fogli modulari di idrogel per un sistema di coltura cellulare 3D. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ingegneria tissutale, ad esempio come creare tessuti di ingegneria funzionale più simili in vivo con microambienti coltivati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i costrutti cellulari di idrogel possono essere generati senza alcun costoso incremento.

Le condizioni di coltura cellulare 3D dipenderanno da ciascun foglio di idrogel modulare. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso il miglioramento dei saggi basati su cellule e degli studi biologici perché la tecnica può fornire varie geometrie e composizioni di micro e macro ambienti cellulari 3D. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui saggi in vitro basati su cellule, può essere applicato anche a un altro sistema, come lo scaffold trapiantabile di un modello di tessuto 3D.

Inizia producendo i modelli su microscala desiderati utilizzando tecniche di fotolitografia standard. L'esempio mostrato in questo video utilizzerà un modello a maglie simile a un lobulo epatico come quello mostrato qui. Quindi, pesare 2,5 grammi di PDMS e 2,5 grammi di soluzione di agente indurente e mescolare accuratamente i componenti.

Degassare la soluzione in una camera a vuoto e quindi distribuire uniformemente la soluzione miscelata sulla superficie del micropattern del wafer di silicio all'interno di un piatto di colata di alluminio. Quindi, polimerizzare il PDMS posizionando il piatto sulla superficie piana di una piastra riscaldata a 65 gradi Celsius per 90 minuti. Una volta indurito, rimuovere il PDMS dalla piastra di colata e staccarlo con cura dal wafer di silicone.

Tagliare i bordi del PDMS e posizionare la parte modellata su una piastra di Petri di 100 millimetri di diametro in modo che il lato del micropattern sia rivolto verso l'alto. Quindi, lavare il PDMS microstrutturato con etanolo al 70%, seguito da acqua distillata, per la sterilizzazione primaria. Successivamente, asciugare completamente il preparato per 10 minuti in forno a 65 gradi Celsius.

Quindi, posiziona lo stampo PDMS microstrutturato in un pulitore al plasma e puliscili per un minuto in modo da creare una superficie idrofila. Ciò faciliterà il caricamento di liquidi acquosi. Quindi rivestire la superficie del PDMS con 100 millilitri della soluzione tensioattiva elencata nella Tabella dei materiali.

Incubare i campioni su un bilanciere da laboratorio per almeno tre ore. Successivamente, lavare la soluzione di tensioattivo dagli stampi PDMS utilizzando acqua sterile e asciugarli completamente in forno a 65 gradi Celsius per 10 minuti. Quindi, sterilizzare ogni stampo micromodellato esponendolo alle radiazioni ultraviolette per 30 minuti.

Inizia coltivando le cellule hepg2 utilizzando tecniche standard. Una volta che le cellule sono confluenti al 70%-80%, lavarle una volta con PBS. Quindi, raccogliere le cellule aggiungendo un milliletro di 05% di tripsina edta e incubarle per quattro minuti a 37 gradi Celsius.

Una volta staccate, raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga e pellettare a 250 g per tre minuti. Rimuovere il surnatante e quindi risospendere le cellule in un milliletro di PBS. Conta il numero di singole celle distribuite in PBS utilizzando un contatore di celle automatizzato.

Quindi, pellettare nuovamente le celle a 250 g per tre minuti. Rimuovere il surnatante PBS e aggiungere una quantità sufficiente di una soluzione di alginato di sodio all'uno per cento alle cellule in modo che la densità di semina finale sia compresa tra cinque e dieci milioni di cellule per milliletro. Miscelare delicatamente la soluzione cellulare utilizzando una pipetta e quindi incubare la sospensione di idrogel cellulare in un incubatore umidificato al cinque percento di CO2 a 37 gradi Celsius.

Mentre le cellule incubano, posizionare gli stampi PDMS micromodellati in un pulitore al plasma e pulirli per un minuto a 85 watt per creare una superficie idrofila. Mescolare la sospensione di idrogel cellulare pipettando delicatamente su e giù, quindi caricare costantemente 7,2 microlitri di sospensione sul bordo del micropattern nello stampo. Quindi, gelificare la sospensione di idrogel cellulare producendo una nebbia del reagente reticolante con l'umidificatore a una velocità di 250 millilitri all'ora e spruzzandola sul precursore dell'idrogel per cinque minuti.

Assicurarsi che questa procedura copra la superficie topografica dello stampo PDMS entro un intervallo di cinque centimetri. Dopo il processo di reticolazione, spegnere l'umidificatore e riempire lo stampo PDMS con PBS. Utilizzando una pipetta da 200 microlitri, erogare delicatamente PBS attorno al bordo dei fogli di idrogel induriti per staccare ciascuno degli idrogel.

Quindi, prelevare ogni foglio di idrogel galleggiante, utilizzando un puntale per pipetta da 1.000 microlitri tagliato all'estremità. Trasferire ogni foglio di idrogel nei singoli pozzetti di una piastra a 12 pozzetti contenente un milliletro di DMEM preriscaldato in modo che galleggino sulla superficie del mezzo. Coltiva le cellule in questo modo per una settimana, scambiando il terreno di coltura a giorni alterni.

Successivamente, produrre un telaio PDMS, che contiene strutture di pilastri alte 170 micron sulla superficie inferiore, come descritto nel protocollo di testo allegato. Durante la fabbricazione, posizionare uno stampo in policarbonato specializzato sul wafer di silicone per il telaio PDMS per creare un telaio interno con una larghezza di otto millimetri, un'altezza di nove millimetri e una profondità di due millimetri. Una volta sterilizzato, posizionare il telaio PDMS su un quarto di pezzo di carta da filtro di nylon incastonato in una capsula di Petri da 60 millimetri.

Rimuovere i fogli di idrogel dall'incubatore e trasferire il primo dei fogli di idrogel modulari all'interno del telaio PDMS utilizzando un puntale per pipetta da 1.000 microlitri tagliato all'estremità. Allineare il bordo del foglio modulare di idrogel con il telaio PDMS utilizzando un puntale per pipetta vuoto da 200 microlitri. Ripetere questo processo con altri fogli di idrogel fino a ottenere una pila da quattro a sei strati.

Quindi, rimuovere il terreno di coltura facendolo scorrere attraverso le strutture dei pilastri nella parte inferiore del telaio PDMS. Quindi, aggiungi due microlitri di una soluzione di alginato al due percento in un angolo del costrutto multistrato. Utilizzando un umidificatore, spruzzare una nebbia del reagente reticolante a una velocità di 250 millilitri all'ora sul costrutto multistrato per trenta secondi per fissare insieme i bordi di ogni strato.

Quindi, sciacquare delicatamente il costrutto multistrato con 400 microlitri di DMEM e rimuovere il telaio PDMS utilizzando una pinzetta. Quindi, aggiungi altri quattro millilitri di DMEM. Staccare il costrutto multistrato con la carta da filtro strofinandolo delicatamente con un sollevatore di cellule, quindi utilizzare la carta da filtro per trasferirlo in una piastra a sei pozzetti contenente tre millilitri di DMEM.

Coltivare le cellule in modo flottante con un costrutto di idrogel come impalcatura cellulare multiscala nella piastra a sei pozzetti per almeno una settimana. Sostituire il terreno di coltura a giorni alterni. Il risultato di un assemblaggio strato per strato di fogli di idrogel micropatinati simili a lobuli epatici è mostrato qui, dove le cellule di carcinoma epatico umano fluorescenti verdi e i fibroblasti NIH-3T3 fluorescenti rossi sono stati cresciuti insieme in co-coltura su una rete combinata.

Utilizzando la tecnica qui presentata, è possibile creare molte variazioni di modello, tra cui pilastri esagonali, maglie sottili, array interi e più microfibre simili a micropettini sotto forma di un sottile costrutto di idrogel dell'ordine di 100-200 micrometri. Queste strutture forniscono un ricco ambiente di coltura 3D per molti tipi di cellule diverse. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come creare fogli di idrogel cellulare per l'ingegneria di sistemi di coltura 3D in vivo dal basso verso l'alto.