Visualizzazione di mRNA reticolo endoplasmatico localizzate in cellule di mammifero

Lo scopo di questa procedura è visualizzare l'RNA messaggero associato al reticolo endoplasmatico o er. Ciò si ottiene prima placcando le cellule di coltura di tessuto di mammifero su vetrini coprioggetti. La seconda fase della procedura consiste nel trattare le cellule con tampone di estrazione per rimuovere l'mRNA citoplasmatico non legato all'er.

I prossimi passi sono fissare rapidamente le cellule e colorare l'mRNA mediante ibridazione fluorescente in situ. I passaggi finali consistono nell'visualizzare e quindi quantificare la quantità di fluorescenza associata all'er. In definitiva, i risultati possono mostrare come gli mRNA sono associati alla superficie di questo organello in diverse condizioni.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla biologia cellulare, come ad esempio se gli mRNA che codificano le proteine secretorie possono essere mantenuti sulla superficie dell'er, indipendentemente dai ribosomi o dalla sintesi proteica. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto comporta alcuni passaggi complicati di manipolazione cellulare. Seminare le cellule di coltura tissutale su vetrini coprioggetti trattati con acido per almeno un giorno prima dell'esperimento costa sette e, a causa dell'OS, le cellule sono entrambe scelte adatte in quanto hanno un'elevata produzione di proteine secrete e ER ben definiti.

Se si sta studiando un Mr NA esogeno, trasfettare le cellule un giorno dopo la semina e poi incubare le cellule per altre 18 ore per consentire la MR. Espressione NA. Il giorno dell'esperimento. Per ottenere un'elevata efficienza di estrazione, le cellule non devono superare l'80% di fluenza di co sul vetrino coprioggetti per rilevare se gli mRNA interagiscono con l'ER indipendentemente dalla traduzione, le cellule possono essere trattate con agenti che interrompono l'interazione tra ribosomi e mRNA in questi agenti o nei terreni di controllo alle cellule 30 minuti prima dell'estrazione.

In questo caso, vengono utilizzati inibitori traduzionali, la micina pura e l'Homo Harrington in o HHT. Inizia riscaldando la soluzione di estrazione appena preparata contenente tonnina di scavo e un tampone di lavoro da un XCHO a 37 gradi Celsius. Imposta un blocco riscaldante a 40 gradi Celsius e inserisci un blocco di metallo invertito per formare una superficie di lavoro piana.

Inumidisci il blocco di metallo con acqua, quindi sovrapponilo con un nuovo pezzo di paraforma e leviga eventuali bolle usando guanti privi di RNA e fazzoletti privi di lanugine. Successivamente, per ogni coppia di vetrini, preparare una piastra a sei pozzetti per il lavaggio e il fissaggio delle celle a quattro pozzetti. Aggiungere due millilitri di tampone CHO riscaldato agli ultimi due pozzetti.

Aggiungere due millilitri di soluzione di fissaggio. Quindi conservare la piastra a 37 gradi Celsius fino al momento del bisogno. Sul blocco riscaldante, posizionare una goccia da 100 microlitri della soluzione di estrazione per ogni vetrino coprioggetto di cellule da lavorare.

Ora, usando una pinza da gioielliere, raccogli un vetrino coprioggetti rivestito di cellule e immergilo nel primo e nel secondo pozzetto contenenti tampone CHO. Questo lava via il terreno di coltura. Quindi rimuovere rapidamente il tampone in eccesso dal retro del vetrino coprioggetti.

Posizionare brevemente la cella di protezione con il lato rivolto verso il basso sulla soluzione di estrazione. Dopo 10 secondi, trasferire la cella del vetrino coprioggetto con il lato rivolto verso l'alto verso il tampone di fissaggio, dove dovrebbe rimanere per almeno 15 minuti. La fase di estrazione cellulare è essenziale per rimuovere tutto l'mRNA plasticoso cyop che non è legato all'ER.

Inoltre, preparare un vetrino coprioggetti di controllo in cui le celle sono fissate senza l'estrazione. Passo dopo il fissaggio. Lavare due volte queste celle di controllo estratte unex con PBS e quindi permeasi in PBS e TRITTON X 100.

Sebbene non sia necessario, le cellule estratte devono essere lavate con la stessa soluzione di PBS e Triton per ridurre la fluorescenza di fondo dopo che le cellule sono state permeate. Lavare due volte i vetrini con PBS per rimuovere il fissativo e il detergente. Successivamente, lavare i vetrini due volte con il 60% di fide in un tampone monouso di citrato di sodio o SSC.

Tuttavia, se si utilizza una sonda oligo DT per pesci per colorare tutte le cellule, il poli mRNA riduce il livello di fide al 25%Successivamente, preparare il tampone di ibridazione con la sonda per pesci. Diluire la sonda di stoccafisso a 0,2 micromolari nella stessa concentrazione di fide nel tampone di ibridazione. Ora prepara la camera di colorazione.

Riempire il fondo di una capsula di Petri da 150 millimetri con acqua. Quindi fai galleggiare un pezzo di paraforma sull'acqua e capovolgi il piatto. La pellicola para aderirà al fondo del piatto mentre l'acqua fuoriesce.

Se ci sono bolle d'aria, rimuoverle con guanti e fazzoletti privi di lanugine per ogni coprioggetto pipettare 100 microlitri della soluzione di ibridazione contenente la sonda di pesce sulla pellicola para. Posizionare ora la cella del vetrino coprioggetto con il lato rivolto verso il basso sulla soluzione. Infine, incubare la camera per cinque-24 ore in una camera calda e umidificata.

Prima che il tempo di colorazione del pesce sia terminato, preparare un'area di lavaggio priva di RNA, una superficie piana più umida con acqua e ricoprirla con strisce di param. Rimuovere eventuali bolle d'aria con guanti e fazzoletti senza lin. Al termine della colorazione, trasferire la camera nell'area di lavoro per ogni vetrino coprioggetto Pipettare un millilitro di tampone di lavaggio sull'area di lavaggio.

Pellicola para per trasferire i vetrini coprioggetto Pipettare prima mezzo millilitro di tampone per il lavaggio del pesce vicino al bordo di ciascun vetrino coprioggetti. Il liquido verrà aspirato sotto il vetrino coprioggetto per azione capillare. Quindi, utilizzando una pinza, rimuovere i vetrini coprioggetto dalla camera e posizionarli sulle gocce di tampone di lavaggio.

E attendi cinque minuti. Ripeti questa tecnica di lavaggio altre tre volte. Utilizzando gocce fresche da un millilitro di tampone di lavaggio sulla zona di lavaggio.

Nel frattempo, pulire i vetrini con etanolo al 70% e asciugarli con fazzoletti privi di lanugine. Quindi, per ogni vetrino coprioggetti, applicare 25 microlitri di soluzione di montaggio DPI su un vetrino Usando una pinza, raccogliere un vetrino coprioggetti e asciugarne il retro con un fazzoletto privo di lanugine per rimuovere il tampone di lavaggio in eccesso. Quindi trasferire il lato della cella del vetrino copricoperchio rivolto verso il basso sulla goccia della soluzione di montaggio.

Le diapositive completate possono essere conservate a quattro gradi Celsius fino al costo dell'immagine. Sette cellule che sono state trasfettate con plasmidi contenenti fosfatasi alcalina placentare o citocromo P 4 58 B uno sono state estratte con tonina e poi fissate o fissate direttamente per determinare la percentuale di questi mRNA associati all'ER. La fluorescenza non nucleare è stata quantificata in entrambi i campioni e la frazione di mRNA associato all'ER è stata calcolata per entrambi gli mRNA.

Circa il 60% della frazione citoplasmatica è stato associato all'ER per monitorare l'associazione ER di questi trascritti. Dopo la dissociazione del ribosoma, sette cellule sono state trattate con terreni di controllo, pur MYCIN o HHT, e quindi hanno estratto la tonina e l'mRNA fissato. La colorazione ha rivelato che l'A LPP, ma non l'mRNA dell'otto P one, è rimasto associato all'ER dopo la rottura del ribosoma.

La quantificazione dell'mRNA ha supportato questa osservazione e ha dimostrato che il livello di mRNA nucleare era coerente in tutti i campioni. Questi dati rivelano che un sottogruppo di mRNA mirati all'ER, come il trascritto A LPP, viene mantenuto sulla superficie dell'ER dopo il disassemblaggio del ribosoma. Utilizzando questo protocollo, possiamo iniziare a studiare come vari mRNA si localizzano in compartimenti subcellulari distinti come il reticolo endoplasmatico quando combinati con altri saggi utilizzati per analizzare l'esportazione nucleare dell'mRNA.

Questa procedura può essere utilizzata per studiare il targeting iniziale di mRNA di nuova sintesi sulla superficie dell'er.